పీటర్ సర్నో, స్టాన్‌ఫోర్డ్ యూనివర్శిటీ స్కూల్ ఆఫ్ మెడిసిన్, స్టాన్‌ఫోర్డ్ యూనివర్సిటీ, కాలిఫోర్నియా ద్వారా ఎడిట్ చేయబడింది, డిసెంబర్ 25, 2020న ఆమోదించబడింది (అక్టోబర్ 25, 2020న సమీక్షించబడింది)
ప్రతిరూపణ మరియు పరిణామ పరిరక్షణకు అవసరమైన కరోనావైరస్లు-ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కాంప్లెక్స్‌ల ప్రతిరూపణలో సబ్‌యూనిట్‌ల మధ్య పరస్పర చర్యను మేము నివేదిస్తాము.nsp12తో అనుబంధించబడిన NiRAN డొమైన్ ట్రాన్స్‌లో న్యూక్లియోసైడ్ మోనోఫాస్ఫేట్ (NMP) ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ యాక్టివిటీని కలిగి ఉందని మరియు nsp9 (ఆర్‌ఎన్‌ఏ బైండింగ్ ప్రోటీన్)ని దాని లక్ష్యంగా గుర్తించామని మేము సాక్ష్యాలను అందించాము.NiRAN Mn2+ అయాన్లు మరియు ప్రక్కనే సంరక్షించబడిన Asn అవశేషాలపై ఆధారపడే ప్రతిచర్యలో సంరక్షించబడిన nsp9 అమైనో టెర్మినస్‌కు NMP మోయిటీ యొక్క సమయోజనీయ అనుబంధాన్ని ఉత్ప్రేరకపరుస్తుంది.కరోనావైరస్ రెప్లికేషన్ కోసం NiRAN కార్యాచరణ మరియు nsp9 NMPylation అవసరమని కనుగొనబడింది.సమూహ వైరస్ ఎంజైమ్ మార్కర్ యొక్క ఈ కార్యాచరణను RNA వైరస్‌ల తరగతిలో RNA సంశ్లేషణ ప్రారంభించడం క్రియాత్మకంగా మరియు పరిణామాత్మకంగా స్థిరంగా ఉంటుందని పరికల్పనలో మునుపటి పరిశీలనలకు లింక్ చేయడానికి డేటా అనుమతిస్తుంది.
Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae, మరియు 12 ఇతర కుటుంబాలు) యొక్క RNA-ఆధారిత RNA పాలిమరేస్ (RdRps) NiRAN అని పిలువబడే పాలీప్రొటీన్ నుండి విడుదలయ్యే నాన్ స్ట్రక్చరల్ ప్రొటీన్ (nsp)లోని అమైనో-టెర్మినల్ (N-టెర్మినల్) డొమైన్‌తో అనుసంధానించబడి ఉంది. 1ab వైరల్ మెయిన్ ప్రోటీజ్ (Mpro)తో కూడి ఉంటుంది.గతంలో, ధమనుల వైరస్ NiRAN-RdRp nsp యొక్క స్వంత GMPylation/UMPylation కార్యాచరణ నివేదించబడింది మరియు (ప్రస్తుతం తెలియని) వైరస్ మరియు/లేదా సెల్ బయోపాలిమరైజేషన్ థింగ్స్‌కు న్యూక్లియోసైడ్ మోనోఫాస్ఫేట్ (NMP) బదిలీ కోసం తాత్కాలికంగా రూపొందించాలని సూచించబడింది.ఇక్కడ, కరోనావైరస్ (హ్యూమన్ కరోనావైరస్ [HCoV]-229E మరియు తీవ్రమైన అక్యూట్ రెస్పిరేటరీ సిండ్రోమ్ కరోనావైరస్ 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+-ఆధారిత NMPylation కార్యాచరణను కలిగి ఉందని, ఇది Mpro-మధ్యవర్తిత్వం తర్వాత nsp9 ఏర్పడటం ద్వారా nsp9 నుండి తీసుకోబడింది. N-టెర్మినల్ ఫ్లాంకింగ్ nsps ప్రోటీయోలైటిక్‌గా విడుదల చేయబడుతుంది, ఫాస్ఫోరామిడేట్ nsp9 యొక్క N-టెర్మినల్ వద్ద ప్రాథమిక అమైన్ (N3825)తో బంధించబడుతుంది.ఈ ప్రతిచర్యలో యురిడిన్ ట్రిఫాస్ఫేట్ ఇష్టపడే న్యూక్లియోటైడ్, అయితే అడెనోసిన్ ట్రిఫాస్ఫేట్, గ్వానోసిన్ ట్రిఫాస్ఫేట్ మరియు సైటిడిన్ ట్రైఫాస్ఫేట్ కూడా తగిన సహ-ఉపరితలాలు.రీకాంబినెంట్ కరోనావైరస్ nsp9 మరియు nsp12 ప్రోటీన్లు మరియు జన్యుపరంగా ఇంజనీరింగ్ చేయబడిన HCoV-229E మార్పుచెందగలవారు ఉపయోగించి మ్యుటేషన్ అధ్యయనాలు NiRAN-మధ్యవర్తిత్వ nsp9 NMPylation మరియు సెల్ కల్చర్‌లో వైరస్ రెప్లికేషన్‌కు అవసరమైన అవశేషాలను నిర్ణయించాయి.డేటా NiRAN యాక్టివ్ సైట్ అవశేషాల అంచనాను నిర్ధారించింది మరియు nsp9 NMPylation మరియు వైరస్ రెప్లికేషన్ ఇన్ విట్రోలో nsp9 N3826 అవశేషాల యొక్క ముఖ్యమైన పాత్రను నిర్ణయించింది.ఈ అవశేషాలు సంరక్షించబడిన N-టెర్మినల్ NNE ట్రిపెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లో భాగం మరియు కరోనావైరస్ కుటుంబంలో nsp9 మరియు దాని హోమోలాగ్‌ల యొక్క ఏకైక మార్పులేని అవశేషంగా నిరూపించబడింది.ఈ అధ్యయనం ఇతర సమూహ వైరస్‌ల యొక్క NMPylation కార్యాచరణ యొక్క క్రియాత్మక అధ్యయనానికి బలమైన పునాదిని అందిస్తుంది మరియు యాంటీవైరల్ ఔషధాల అభివృద్ధికి సాధ్యమయ్యే లక్ష్యాలను ప్రతిపాదిస్తుంది.
నిడోవైరల్స్ పాజిటివ్ స్ట్రాండెడ్ ఆర్‌ఎన్‌ఏ వైరస్ వివిధ రకాల సకశేరుకాలు మరియు అకశేరుకాలను సోకుతుంది (1, 2).ఈ క్రమంలో ప్రస్తుతం 14 కుటుంబాలు (3) ఉన్నాయి, వీటిలో కరోనావైరస్ కుటుంబం గత 20 ఏళ్లలో విస్తృతంగా అధ్యయనం చేయబడింది.ఆ సమయంలో, జంతు అతిధేయల నుండి మూడు జూనోటిక్ కరోనావైరస్లు ఉద్భవించాయి మరియు మానవులలో తీవ్రమైన శ్వాసకోశ ఇన్ఫెక్షన్ల యొక్క పెద్ద ఎత్తున వ్యాప్తికి కారణమయ్యాయి.తీవ్రమైన తీవ్రమైన అంటు వ్యాధుల వల్ల వచ్చే నిరంతర మహమ్మారితో సహా.రెస్పిరేటరీ సిండ్రోమ్ కరోనా వైరస్ 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).నిడోవైరస్‌లు ఒక సాధారణ జన్యు సంస్థను పంచుకుంటాయి మరియు మెమ్బ్రేన్-బౌండ్ రెప్లికేషన్-ట్రాన్స్క్రిప్షన్ కాంప్లెక్స్ (RTC) యొక్క సబ్‌యూనిట్ 5-?²-టెర్మినల్ మూడింట రెండు వంతుల మరియు వైరస్ కణం యొక్క ప్రధాన నిర్మాణ ఉపవిభాగం, అలాగే కొన్ని ఉపకరణాలలో ఎన్‌కోడ్ చేయబడింది. .ప్రొటీన్, జన్యువు (1) యొక్క 3??² ముగింపు మూడవ భాగంలో ఎన్‌కోడ్ చేయబడింది.ప్లానేరియన్ వైరస్‌ల కుటుంబం (మోనోవిరిడే) (8) మినహా అన్ని సమూహ వైరస్‌లు RTC సబ్‌యూనిట్‌లను రెండు పెద్ద ఓపెన్ రీడింగ్ ఫ్రేమ్‌లలో (ORF) ORF1a మరియు ORF1b ఎన్‌కోడ్ చేస్తాయి, ఇవి జెనోమిక్ RNA నుండి అనువదించబడ్డాయి.ORF1a పాలీప్రొటీన్ (pp) 1aని ఎన్‌కోడ్ చేస్తుంది మరియు ORF1a మరియు ORF1b సంయుక్తంగా pp1abని ఎన్‌కోడ్ చేస్తాయి.ORF1a ద్వారా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన ప్రధాన ప్రోటీజ్ (Mpro) యొక్క సాధారణ భాగస్వామ్యంతో, pp1a మరియు pp1ab రెండూ ప్రొటీయోలైటికల్‌గా వివిధ నిర్మాణేతర ప్రోటీన్‌లుగా (nsps) ప్రాసెస్ చేయబడతాయి, దీనిని 3CLpro అని కూడా పిలుస్తారు, ఎందుకంటే ఇది పికార్నావైరస్ యొక్క 3Cproతో హోమోలజీని కలిగి ఉంటుంది ( 9)ఈ nspsలు ఒక పెద్ద డైనమిక్ RTCగా సమీకరించబడి, జన్యుసంబంధమైన RNA (రెప్లికేషన్) మరియు సబ్జెనోమిక్ RNA (ట్రాన్స్క్రిప్షన్) యొక్క సంశ్లేషణను ఉత్ప్రేరకపరుస్తాయి మరియు ORF1b (10? ?) దిగువన ఉన్న ORF యొక్క వ్యక్తీకరణను సమన్వయం చేయడానికి ఉపయోగించబడతాయి. ?12).
కోర్ RTCలో RNA-ఆధారిత RNA పాలిమరేస్ (RdRp) (13), సూపర్‌ఫ్యామిలీ 1 హెలికేస్ (HEL1) (14, 15) మరియు అనేక RNA ప్రాసెసింగ్ ఎంజైమ్‌లు ఉన్నాయి, ఇవి ప్రధానంగా ORF1bలో ఎన్‌కోడ్ చేయబడ్డాయి మరియు కరోనావైరస్ కుటుంబంలో nsp12-nsp16 మరియు ఆర్టెరియోవైరిడే కుటుంబంలో nsp9-nsp12 (రిఫరెన్స్ 10ââ 12 చూడండి).RdRp మరియు HEL1 పక్షుల గూడు వైరస్ యొక్క రెండు (ఐదవ వంతు) సంరక్షించబడిన డొమైన్‌లను సూచిస్తాయి మరియు ఇతర RNA వైరస్‌లలో హోమోలజీని కలిగి ఉంటాయి.pp1a యొక్క కార్బాక్సీ-టెర్మినల్ (C-టెర్మినల్) ప్రాంతం నుండి విడుదల చేయబడిన అనేక చిన్న nsps, Mpro దిగువన (కరోనావైరస్ nsp5 మరియు ధమనుల వైరస్ nsp4, వరుసగా) సహా ఇతర ఉపవిభాగాల ద్వారా కోర్ రెప్లికేస్‌కు సహాయం అందుతుందని నమ్ముతారు.వారు పరిమిత కుటుంబ-నిర్దిష్ట రక్షణ మరియు విభిన్న కార్యకలాపాలను కలిగి ఉన్నారు (రిఫరెన్స్ 10ââ12లో సమీక్షించబడింది).
సాపేక్షంగా ఇటీవల, అన్ని సమూహ వైరస్‌లలో RdRp ప్రక్కనే ఉన్న అమైనో టెర్మినస్ (N-టెర్మినస్) వద్ద ప్రత్యేకమైన సీక్వెన్స్ మోటిఫ్ లక్షణాలతో కూడిన డొమైన్ కనుగొనబడింది, కానీ ఇతర RNA వైరస్‌లు లేవు (16).దాని స్థానం మరియు న్యూక్లియోటైడ్ ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ (న్యూక్లియోసైడ్ మోనోఫాస్ఫేట్ [NMP] ట్రాన్స్‌ఫేరేస్) కార్యాచరణ ఆధారంగా, ఈ డొమైన్‌కు NiRAN (Nestvirus RdRp-సంబంధిత న్యూక్లియోటైడ్ బదిలీ) అని పేరు పెట్టారు.NiRAN-RdRp యొక్క ద్వంద్వ-డొమైన్ కలయిక కరోనావిరిడే కుటుంబంలో nsp12 మరియు ఆర్టెరియోవిరిడే కుటుంబంలో nsp9 మరియు ఇతర నెస్టోవిరిడేలలో, NiRAN-RdRp వైరల్ పాలీప్రొటీన్ నుండి స్వతంత్ర nspగా విడుదల చేయబడుతుందని భావిస్తున్నారు.కరోనావైరస్లో, NiRAN డొమైన్ ??1/450 అవశేషాలను కలిగి ఉంది మరియు లింకర్ ప్రాంతం (16.19) ద్వారా C-టెర్మినల్ RdRp డొమైన్‌కు కనెక్ట్ చేయబడింది.ఈక్విన్ ఆర్టెరిటిస్ వైరస్ (EAV) (ఆర్టెరివిరిడే)లో, రీకాంబినెంట్ nsp9 Mn2+ అయాన్-ఆధారిత (స్వయం) UMPylation మరియు GMPylation కార్యకలాపాలను చూపుతుంది, ఇది నెస్టోవైరస్, AN, BN మరియు CNలలోని మూడు సంరక్షించబడిన సీక్వెన్స్ బేస్‌లపై ఆధారపడి ఉంటుంది.ఇక్కడ N అంటే NiRAN) (16).ఈ మూలాంశాల యొక్క N-టెర్మినల్ పార్శ్వం తక్కువ సాంప్రదాయిక మూలాంశం preAN.ఈ అవశేషాలలో కొన్ని సుదూర సంబంధిత ప్రోటీన్ కైనేస్‌లలో కూడా భద్రపరచబడ్డాయి, ఇక్కడ అవి న్యూక్లియోసైడ్ ట్రైఫాస్ఫేట్ (NTP) బైండింగ్ మరియు ఉత్ప్రేరక చర్య (20, 21)లో పాల్గొన్నట్లు చూపబడింది.ఈ పరిశీలనకు అనుగుణంగా, ఇటీవల ప్రచురించిన SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 సూపర్‌కాంప్లెక్స్‌తో సూడోమోనాస్ సిరింగే నుండి సూడోకినేస్ SelOలోని అనేక కీలక క్రియాశీల సైట్ అవశేషాలను సమీకరించవచ్చు.సంరక్షించబడిన కరోనావైరస్ NiRAN అవశేషాలు ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్ట్రక్చర్‌లో సూపర్మోస్ చేయబడ్డాయి.రీకాంబినెంట్ ప్రోటీన్ (17).డాక్యుమెంట్ చేయబడిన (స్వీయ) U/GMPylation NMPని (ప్రస్తుతం తెలియని) సబ్‌స్ట్రేట్ (16)కి బదిలీ చేయడానికి ఒక తాత్కాలిక స్థితిని ఉత్పత్తి చేస్తుందని ఊహించబడింది మరియు NiRAN మరియు ప్రోటీన్ కినేస్ మధ్య నిర్మాణ సారూప్యత (17, 19) ) అనేది పరికల్పన. NiRAN ఇతర ప్రొటీన్లను సవరిస్తుంది.
సమూహ వైరస్‌లతో దాని ప్రత్యేకమైన మరియు ప్రత్యేకమైన క్రమబద్ధమైన అనుబంధం మరియు RdRp నుండి జన్యుపరమైన విభజనతో సహా అనేక లక్షణాలు, NiRAN ని సమూహ వైరస్‌లకు సహేతుకమైన కీలక నియంత్రణ ఎంజైమ్‌గా చేస్తాయి, ఇది వాటి ఆవిర్భావం మరియు గుర్తింపుకు కీలకం.మునుపు, జీనోమ్/సబ్జెనోమిక్ ట్రాన్స్‌లేషన్ లేదా రెప్లికేషన్/ట్రాన్స్‌క్రిప్షన్‌ను నియంత్రించడానికి NiRANతో కూడిన మూడు సాధ్యమైన ఫంక్షన్‌లను పిలిచేవారు.ఆ సమయంలో అందుబాటులో ఉన్న కొరత మరియు అసంపూర్ణ డేటాను పరిగణనలోకి తీసుకున్నప్పుడు, ప్రతి ఫంక్షన్‌కు దాని ప్రయోజనాలు మరియు అప్రయోజనాలు ఉన్నాయి (16).ఈ పరిశోధనలో, మేము రెండు జాతులను సూచించే కరోనావైరస్ల యొక్క జీవరసాయన మరియు రివర్స్ జన్యు అధ్యయనాలను మిళితం చేయడం మరియు ఈ మిస్టీరియస్ రాజ్యం గురించి అంతర్దృష్టిని పొందడానికి, కరోనావైరస్ కుటుంబం యొక్క సహజ మ్యుటేషన్ యొక్క పరిణామ నేపథ్యంలో మా పరిశోధనలను ఉంచడం లక్ష్యంగా పెట్టుకున్నాము.మేము RTCలో సహజ లక్ష్యాలను గుర్తించడం ద్వారా NiRAN యొక్క అవగాహనలో ప్రధాన పురోగతిని నివేదిస్తాము, ఇది (అందుబాటులో ఉన్న మూడు పరికల్పనలలో) సమూహ వైరస్ RNA యొక్క సంశ్లేషణను ప్రారంభించడంలో ఈ డొమైన్ పాత్రకు దోహదం చేస్తుంది.ఈ పరిశోధన వైరస్ హోస్ట్ ఇంటర్‌ఫేస్‌లో NiRAN యొక్క ఇతర పాత్రల కోసం అవకాశాలను కూడా తెరుస్తుంది.
కరోనా వైరస్ nsp12-సంబంధిత NiRAN డొమైన్ యొక్క ఎంజైమాటిక్ లక్షణాలను వర్గీకరించడానికి, మేము C-టెర్మినస్ వద్ద His6 ట్యాగ్‌తో E. coliలో హ్యూమన్ కరోనావైరస్ 229E (HCoV-229E) nsp12 యొక్క రీకాంబినెంట్ రూపాన్ని ఉత్పత్తి చేసాము మరియు వాటిని కలిపి మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్‌లో వివరించిన విధంగా [α32-P ]తో ప్రోటీన్ MnCl2 సమక్షంలో NTPతో కలిసి పొదిగేది.ప్రతిచర్య ఉత్పత్తి యొక్క విశ్లేషణ nsp12 (106 kDa)తో రేడియోలేబుల్ చేయబడిన ప్రోటీన్ ఉనికిని సూచించింది, ఇది కరోనావైరస్ nsp12 సమయోజనీయ ప్రోటీన్-NMP వ్యసనాల ఏర్పాటును ఉత్ప్రేరకపరుస్తుందని సూచిస్తుంది, ప్రాధాన్యంగా యూరిడిన్ మోనోఫాస్ఫేట్ (UMP) (మూర్తి 1A) మరియు బి).ఇతర న్యూక్లియోటైడ్‌లతో పోలిస్తే, UMP విలీనం యొక్క సిగ్నల్ తీవ్రత 2 నుండి 3 రెట్లు పెరిగిందని పరిమాణాత్మక విశ్లేషణ చూపించింది (మూర్తి 1C).ఈ డేటా కరోనావైరస్ (16) యొక్క NiRAN డొమైన్ యొక్క అంచనా వేయబడిన NMP బదిలీ కార్యకలాపానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది, అయితే కరోనావైరస్ మరియు ధమని వైరస్ యొక్క NiRAN డొమైన్ యొక్క న్యూక్లియోటైడ్ ప్రాధాన్యతలు భిన్నంగా ఉన్నాయని సూచిస్తుంది.
HCoV-229E nsp12 యొక్క స్వీయ-NMPylation చర్య.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) 6 mM MnCl2 సమక్షంలో 30 నిమిషాల పాటు నియమించబడిన [α-32P] NTPతో పొదిగేది (వివరాల కోసం మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్ చూడండి).ప్రతిచర్య ఉత్పత్తులు SDS-PAGE ద్వారా వేరు చేయబడ్డాయి మరియు కూమాస్సీ బ్రిలియంట్ బ్లూతో తడిసినవి.(B) రేడియోలేబుల్ చేయబడిన ప్రోటీన్ ఫాస్పరస్ ఇమేజింగ్ ద్వారా దృశ్యమానం చేయబడుతుంది.nsp12-His6 మరియు ప్రొటీన్ మాలిక్యులర్ మాస్ మార్కర్స్ (కిలోడాల్టన్లలో) స్థానాలు A మరియు B. (C)లో రేడియోధార్మిక సిగ్నల్ (సగటు ± SEM) యొక్క తీవ్రత మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి నిర్ణయించబడింది.*P≤0.05.సిగ్నల్ బలం (శాతం) UTPకి సంబంధించినది.
సెల్ కల్చర్ (16)లో EAV మరియు SARS-CoV యొక్క ప్రతిరూపణకు NiRAN-సంబంధిత ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలు అవసరమని చూపినప్పటికీ, నిర్దిష్ట NiRAN పనితీరు మరియు సంభావ్య లక్ష్యాలు ఇంకా నిర్ణయించబడలేదు.NiRAN మరియు ప్రోటీన్ కినేస్ లాంటి మడతలు (17, 22) ఉన్న ప్రోటీన్ల కుటుంబం మధ్య ఇటీవల నివేదించబడిన నిర్మాణ సారూప్యత NiRAN ఇతర ప్రోటీన్ల NMPylationని ఉత్ప్రేరకపరుస్తుందనే పరికల్పనను పరీక్షించడానికి మమ్మల్ని ప్రేరేపించింది.మేము HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10) ద్వారా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన నాన్-స్ట్రక్చరల్ ప్రొటీన్‌లతో సహా సంభావ్య హోమోలాగస్ లక్ష్యాల సమితిని రూపొందించాము, ప్రతి ఒక్కటి C-టెర్మినల్ His6 ట్యాగ్ (SI అనుబంధం, టేబుల్ S1) , మరియు nsp12 సమక్షంలో లేదా లేకపోవడంతో ఈ ప్రోటీన్లను [α32-P] యూరిడిన్ ట్రైఫాస్ఫేట్ ([α32-P]UTP)తో పొదిగించండి.E. కోలిలో ఉత్పత్తి చేయబడిన బోవిన్ సీరం అల్బుమిన్ మరియు MBP-LacZα ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ నియంత్రణలుగా పనిచేసింది (మూర్తి 2A, లేన్లు 1 నుండి 7 వరకు).రేడియోలేబుల్ చేయబడిన ప్రోటీన్‌ను సోడియం డోడెసిల్ సల్ఫేట్-పాలియాక్రిలమైడ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ (SDS-PAGE) మరియు ఆటోరాడియోగ్రఫీ ద్వారా విశ్లేషించారు మరియు nsp12 మరియు nsp9 కలిగిన ప్రతిచర్యలో బలమైన రేడియోధార్మిక సిగ్నల్ ఉన్నట్లు కనుగొనబడింది.సిగ్నల్ యొక్క స్థానం nsp9 యొక్క పరమాణు ద్రవ్యరాశికి అనుగుణంగా ఉంటుంది, ఇది nsp9 యొక్క nsp12-మధ్యవర్తిత్వ UMPylationని సూచిస్తుంది (మూర్తి 2B, ట్రాక్ 7).ఇతర టెస్ట్ ప్రొటీన్లు UMPylated ఉన్నట్లు కనుగొనబడలేదు, ఇది nsp9 అనేది nsp12 యొక్క నిర్దిష్ట సబ్‌స్ట్రేట్ అని నిర్ధారించడానికి దారితీసింది.మూర్తి 1లో చూపిన స్వీయ-NMPylation డేటాకు అనుగుణంగా, nsp12 మొత్తం నాలుగు NMPలను nsp9కి బదిలీ చేయగలదు, అయితే సామర్థ్యం భిన్నంగా ఉన్నప్పటికీ, UMP> అడెనోసిన్ మోనోఫాస్ఫేట్ (AMP)> గ్వానోసిన్ మోనోఫాస్ఫేట్ (GMP)> సైటిడిన్ మోనోఫాస్ఫేట్ (CMP) ) ( చిత్రం).3 A మరియు B).ఈ పరీక్షలో ఉపయోగించిన పరిస్థితులలో (ప్రతిస్పందన మరియు బహిర్గతం సమయాన్ని తగ్గించండి, nsp12 యొక్క ఏకాగ్రతను తగ్గించండి; పదార్థాలు మరియు పద్ధతులు), nsp12 యొక్క స్వీయ-NMPylation కనుగొనబడలేదు (Figure 2B, లేన్ 7 మరియు Figure 1B సరిపోల్చండి), ఇది ప్రభావవంతంగా నిరూపించబడింది (మరియు బహుళ రౌండ్లు) UMP nsp12 నుండి nsp9కి మార్చబడింది.UMP బదిలీ కార్యకలాపానికి మూర్తి 3Cలో చూపిన విధంగా Mn2+ అయాన్ల ఉనికి అవసరం, అయితే Mg2+ సమక్షంలో కనిష్ట UMP బదిలీ కార్యకలాపం మాత్రమే గమనించబడింది మరియు పరీక్షించిన ఇతర రెండు డైవాలెంట్ కాటయాన్‌ల సమక్షంలో ఎటువంటి కార్యాచరణ లేదు.సైటిడిన్ ట్రిఫాస్ఫేట్ (CTP), గ్వానోసిన్ ట్రిఫాస్ఫేట్ (GTP) మరియు అడెనోసిన్ ట్రైఫాస్ఫేట్ (ATP) (SI అనుబంధం, మూర్తి S1) కలిగిన NMPylation పరీక్షలలో ఇలాంటి డేటా పొందబడింది.
nsp9 యొక్క HCoV-229E nsp12-మధ్యవర్తిత్వ UMPylation.HCoV-229E nsp12-Homediated యొక్క UMPylation కార్యాచరణను అంచనా వేయడానికి ప్రోటీన్ సబ్‌స్ట్రేట్‌ల శ్రేణి (బోవిన్ సీరం అల్బుమిన్, MBP-lacZα మరియు ORF1a చే ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన C-టెర్మినల్ His6తో లేబుల్ చేయబడిన HCoV-229E nsps శ్రేణి) ఉపయోగించబడ్డాయి. ప్రోటీన్.పదార్థాలు మరియు పద్ధతులలో వివరించిన విధంగా nsp12 లేనప్పుడు (A) లేదా ఉనికిలో (B) 10 నిమిషాల పాటు [α-32P] UTPతో ప్రోటీన్‌ను పొదిగించండి.A మరియు B ఎగువన, Coomassie Brilliant Blueతో తడిసిన SDS-పాలియాక్రిలమైడ్ జెల్ చూపబడింది మరియు A మరియు B దిగువన, సంబంధిత ఆటోరాడియోగ్రామ్‌లు చూపబడతాయి.ప్రోటీన్ మాలిక్యులర్ మాస్ మార్కర్ యొక్క స్థానం (కిలోడాల్టన్లలో) ఎడమవైపు ఇవ్వబడింది.nsp12-His6 (B, టాప్) యొక్క స్థానం మరియు nsp9-His6 (B, లేన్ 7)తో nsp12-His6 పొదిగే సమయంలో గమనించిన రేడియోధార్మిక సిగ్నల్ కూడా సూచించబడ్డాయి, ఇది [α-32P]UMP నుండి nsp9-His6 వరకు ఉంటుందని సూచిస్తుంది. (12.9 kDa), ఇది పరీక్షించిన ఇతర ప్రోటీన్ల కోసం గమనించబడలేదు.
HCoV-229E NiRAN-మెడియేటెడ్ బయోకెమికల్ అండ్ వైరోలాజికల్ క్యారెక్టరైజేషన్ ఆఫ్ nsp9 NMPylation.(A మరియు B) ప్రతిచర్యలో ఉపయోగించే న్యూక్లియోటైడ్ కో-సబ్‌స్ట్రేట్ పాత్ర.Nsp12-His6 మరియు nsp9-His6 ప్రామాణిక NMPylation పరీక్షలో విభిన్న [α-32P] NTPల సమక్షంలో మిశ్రమంగా మరియు పొదిగేవి.(A, టాప్) Coomassie-స్టెయిన్డ్ nsp9-His6 SDS-PAGE ద్వారా వేరు చేయబడింది.(A, దిగువన) జెల్ యొక్క అదే ప్రాంతం యొక్క ఆటోరేడియోగ్రాఫ్.(B) నియమించబడిన న్యూక్లియోటైడ్ కోఫాక్టర్ సమక్షంలో సాపేక్ష కార్యాచరణ (సగటు ± SEM) మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి నిర్ణయించబడుతుంది.*P≤0.05.(C) లోహ అయాన్ల పాత్ర.[α-32P] UTP మరియు విభిన్న లోహ అయాన్ల సమక్షంలో ప్రామాణిక NMPylation పరీక్ష చూపబడింది, ప్రతి ఒక్కటి 1 mM గాఢతతో ఉంటుంది.Cలో, పైభాగంలో, Coomassie స్టెయిన్డ్ nsp9-His6 చూపబడింది మరియు Cలో, దిగువన, సంబంధిత ఆటోరాడియోగ్రఫీ చూపబడుతుంది.లేబుల్ చేయబడిన ప్రోటీన్ యొక్క పరిమాణం (కిలోడాల్టన్లలో) A మరియు C యొక్క ఎడమవైపు చూపబడింది. (D) HCoV-229E nsp12-His6 యొక్క ఉత్పరివర్తన రూపంలో పేర్కొన్న అమైనో ఆమ్లం ప్రత్యామ్నాయం [α-32P]UTPలో ఉంది, వివరించబడింది మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్ లో.NMPylation ప్రతిచర్యలో ఉత్పత్తి చేయబడిన రేడియోలేబుల్ చేయబడిన nsp9-His6 ఫాస్ఫోరైలేషన్ ఇమేజింగ్ (D, టాప్) ద్వారా కనుగొనబడుతుంది.వైల్డ్-టైప్ (wt) ప్రోటీన్‌తో పోల్చిన సాపేక్ష కార్యాచరణ D లో చూపబడింది మరియు మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి దిగువన సగటు (±SEM)గా తీసుకోబడుతుంది.ఆస్టరిస్క్‌లు సంరక్షించబడని అవశేషాల ప్రత్యామ్నాయాలను సూచిస్తాయి.(ఇ) సంక్రమణ తర్వాత 24 గంటల తర్వాత పొందిన p1 కణాల సంస్కృతి సూపర్‌నాటెంట్‌లోని వైరస్ టైటర్ ఫలకం పరీక్ష ద్వారా నిర్ణయించబడుతుంది.ఇంజనీరింగ్ చేయబడిన HCoV-229E ఉత్పరివర్తన యొక్క NiRAN డొమైన్‌లోని కోడాన్ ప్రత్యామ్నాయాలు సూచించబడ్డాయి (అవశేషాల సంఖ్య pp1abలో వాటి స్థానంపై ఆధారపడి ఉంటుంది).రెప్లికేషన్-లోపం ఉన్న RdRp క్రియాశీల సైట్ మ్యూటాంట్ nsp12_DD4823/4AA నియంత్రణగా ఉపయోగించబడింది.
NiRAN యొక్క క్రియాశీల సైట్‌పై లోతైన అవగాహన పొందడానికి మరియు nsp9-నిర్దిష్ట NMP ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ యొక్క కార్యాచరణకు సంబంధించిన అవశేషాలను గుర్తించడానికి, మేము మ్యుటేషన్ విశ్లేషణను చేసాము, దీనిలో మేము NiRAN AN, BN మరియు CN మూలాంశాలలో సాంప్రదాయిక అవశేషాలను భర్తీ చేసాము ( 16) ఇది అలా (SI అనుబంధం, మూర్తి S2).అదనంగా, సంప్రదాయవాద Arg-to-Lys లేదా Lys-to-Arg ప్రత్యామ్నాయాల ప్రభావం రెండు సందర్భాలలో మూల్యాంకనం చేయబడింది.(ప్రతికూల) నియంత్రణగా, కరోనావైరస్లు మరియు ఇతర సమూహ వైరస్‌ల NiRAN డొమైన్‌లో సంరక్షించబడని లేదా తక్కువ అవశేషాలు Alaతో భర్తీ చేయబడతాయి. K4116A (మోటిఫ్ ప్రీఏఎన్‌లో), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (మూలాంశం) BN) మరియు D4280A (CN) nsp12 ద్వారా nsp9 NMPylationని గణనీయంగా తగ్గిస్తుంది లేదా తొలగిస్తుంది, అయితే సాంప్రదాయిక ప్రత్యామ్నాయాలు (R4178K) , K4116R) కలిగిన ప్రొటీన్లు 60% మరియు 80% తమ కార్యాచరణను కలిగి ఉంటాయి, ఇది వారి సంబంధిత వైపు పరిమితుల సడలింపును సూచిస్తుంది. గొలుసులు భౌతిక రసాయనికంగా సున్నితమైనవి (మూర్తి 3D).అనేక ఇతర సంరక్షించబడిన అవశేషాలను భర్తీ చేయడం E4145A, D4273A, F4281A మరియు D4283A చాలా తక్కువ హానికరం మరియు nsp9 UMPylation మధ్యస్తంగా మాత్రమే తగ్గించబడుతుంది.ఇతర NTPలు (Figure 3D మరియు SI అనుబంధం, Figure S3)తో కూడిన nsp9 NMPylation ప్రతిచర్యలలో ఇలాంటి ఫలితాలు పొందబడ్డాయి, నిర్దిష్ట అమైనో ఆమ్ల ప్రత్యామ్నాయాలపై గమనించిన ప్రభావాలు ఉపయోగించిన న్యూక్లియోటైడ్ కో-సబ్‌స్ట్రేట్ రకం నుండి స్వతంత్రంగా ఉన్నాయని నిర్ధారిస్తుంది.తరువాత, సెల్ కల్చర్‌లో కరోనావైరస్ల ప్రతిరూపణపై ఈ nsp12 ప్రత్యామ్నాయాల యొక్క సాధ్యమైన ప్రభావాన్ని మేము పరీక్షించాము.ఈ క్రమంలో, మేము 5 -7 కణాలను లిప్యంతరీకరించడానికి రీకాంబినెంట్ వ్యాక్సినియా వైరస్ (23, 24)లో క్లోన్ చేయబడిన తగిన జన్యు ఇంజనీరింగ్ కాంప్లిమెంటరీ DNA (cDNA) టెంప్లేట్‌లను ఉపయోగించాము.ఈ కణాలలో ఉత్పత్తి చేయబడిన ఇన్ఫెక్షియస్ వైరస్ సంతానం యొక్క టైట్రేషన్ చాలా HCoV-229E NiRAN మార్పుచెందగలవారు సాధ్యం కాదని చూపించింది (మూర్తి 3E).ఆచరణీయం కాని వైరల్ మార్పుచెందగలవారి సమూహం విట్రో (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A)లో NMP ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ యాక్టివిటీని తొలగించడానికి లేదా గణనీయంగా తగ్గించడానికి ప్రత్యామ్నాయాలను కలిగి ఉంది, అయితే రెండు ఇతర ప్రత్యామ్నాయాలు ఉన్నాయి (K4116R, E81045A) % రిజర్వ్ చేయబడిందా?వారి ఇన్ విట్రో NMPylation కార్యాచరణ అదనపు పరిమితులను కలిగి ఉందని సూచిస్తుంది.అదేవిధంగా, NiRAN యొక్క ఇన్ విట్రో NMPylation కార్యాచరణలో మితమైన తగ్గుదలకు కారణమైన మరో రెండు ఉత్పరివర్తనలు (R4178K, F4281A) ప్రత్యక్ష వైరస్‌లను ఉత్పత్తి చేశాయి, అయినప్పటికీ, ఈ వైరస్‌లు ప్రతిరూపణ ద్వారా టైటర్‌లను గణనీయంగా తగ్గించాయి.మూర్తి 3Dలో చూపిన ఇన్ విట్రో యాక్టివిటీ డేటాకు అనుగుణంగా, కరోనావైరస్ మరియు/లేదా ఇతర సమూహ వైరస్‌లలో (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) సంరక్షించబడని నాలుగు ఇతర అవశేషాలను భర్తీ చేయడం ద్వారా (8, 16) సంతానం ఉన్నప్పటికీ ఆచరణీయ వైరస్‌లను ఉత్పత్తి చేసింది. వైల్డ్-టైప్ వైరస్‌తో పోలిస్తే మధ్యస్తంగా తగ్గిన టైటర్ (మూర్తి 3E).
NiRAN-మధ్యవర్తిత్వ NMP బదిలీ కార్యకలాపం సక్రియ RdRp డొమైన్‌పై ఆధారపడి ఉంటుందో లేదో అధ్యయనం చేయడానికి, RdRp మూలాంశం Cలోని డైవాలెంట్ మెటల్ అయాన్ల (11) సమన్వయంలో పాల్గొన్న రెండు సంరక్షించబడిన Asp అవశేషాలు Ala ద్వారా భర్తీ చేయబడ్డాయి. ఫలితంగా ఏర్పడిన ప్రోటీన్ nsp12_DD4823/4AA నిలుపుకుంటుంది. దాని nsp9 NMPylation యాక్టివిటీ, nsp12-మెడియేటెడ్ ఇన్ విట్రో nsp9 NMPylation యాక్టివిటీకి పాలిమరేస్ యాక్టివిటీ అవసరం లేదని సూచిస్తుంది (SI అపెండిక్స్, ఫిగర్ S4).
nsp12 కోసం nsp9-నిర్దిష్ట NMP బదిలీ కార్యాచరణను స్థాపించిన తర్వాత, మేము మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS) ద్వారా NMP-nsp9 వ్యసనాన్ని వర్గీకరించడానికి ప్రయత్నించాము.రీకాంబినెంట్ HCoV-229E nsp9 యొక్క పూర్తి ప్రోటీన్ మాస్ స్పెక్ట్రమ్ 12,045 Da వద్ద గరిష్ట స్థాయిని చూపింది (మూర్తి 4A).nsp12 యొక్క జోడింపు nsp9 యొక్క నాణ్యతను మార్చలేదు, ఉపయోగించిన పరిస్థితులలో (డినాటరేషన్) (Figure 4A) nsp12 మరియు nsp9 స్థిరమైన కాంప్లెక్స్‌ను ఏర్పరచవని సూచిస్తుంది.UTP మరియు GTP సమక్షంలో, nsp9 మరియు nsp12 కలిగిన ప్రతిచర్య యొక్క ద్రవ్యరాశి కొలత వరుసగా UTP యొక్క ప్రోటీన్ ద్రవ్యరాశి 306 Da మరియు GTP యొక్క ప్రోటీన్ ద్రవ్యరాశి 345 Da తరలించబడిందని చూపింది, ఇది ప్రతి nsp9 అణువు UMP లేదా GMPని బంధిస్తుందని సూచిస్తుంది. (చిత్రం 4) సి మరియు డి).NiRAN-మధ్యవర్తిత్వ nsp9 NMPylation కోసం అవసరమైన శక్తి NTP జలవిశ్లేషణ మరియు పైరోఫాస్ఫేట్ విడుదల నుండి వస్తుందని ఊహించబడింది.ఈ ప్రతిచర్యలో nsp12 (ఎంజైమ్) కంటే 10 రెట్లు ఎక్కువ మోలార్ nsp9 (లక్ష్యం) ఉపయోగించబడినప్పటికీ, nsp9 యొక్క దాదాపు పూర్తి NMPylation గమనించబడింది, nsp12 మరియు nsp9 మధ్య పరస్పర చర్య స్వల్పకాలికం అని సూచిస్తుంది మరియు nsp12 NMP9ని ఎక్కువ NMPylate చేయగలదు. ఇన్ విట్రో అణువు.
nsp12 మరియు UTP లేదా GTP సమక్షంలో nsp9 యొక్క ఒకే NMPylation.HCoV-229E nsp9 (SI అనుబంధం, టేబుల్ S1) (AD) యొక్క డీకన్వాల్యూట్ చేయబడిన పూర్తి ప్రోటీన్ మాస్ స్పెక్ట్రమ్ చూపబడింది.(A) nsp9 మాత్రమే, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTP సమక్షంలో, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTP సమక్షంలో.
nsp12 ద్వారా UMPylated చేసిన nsp9 అవశేషాలను గుర్తించడానికి, nsp9-UMP ట్రిప్సిన్‌తో క్లీవ్ చేయబడింది.ఫలితంగా పెప్టైడ్‌లు నానో-హై పెర్ఫార్మెన్స్ లిక్విడ్ క్రోమాటోగ్రఫీ (HPLC) ద్వారా వేరు చేయబడ్డాయి మరియు ఆన్‌లైన్‌లో టెన్డం మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీ (MS/MS) ద్వారా విశ్లేషించబడ్డాయి.బైయోనిక్ సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీ (ప్రోటీన్ మెట్రిక్స్) ఉపయోగించి డేటా విశ్లేషణ N-టెర్మినల్ అమైనో ఆమ్లం యొక్క UMPylationని చూపింది.ఇది మానవీయంగా నిర్ధారించబడింది.పూర్వగామి పెప్టైడ్ [UMP]NNEIMPGK (SI అనుబంధం, Figure S5A) యొక్క టెన్డం మాస్ స్పెక్ట్రమ్ 421 m/z వద్ద ఒక భాగాన్ని వెల్లడించింది, ఇది UMP nsp9 యొక్క 1 అవశేషానికి కట్టుబడి ఉందని సూచిస్తుంది.
nsp9 యొక్క N-టెర్మినస్‌లో, ఆర్థోకోరోనావిరినే (SI అనుబంధం, మూర్తి S6) సభ్యులలో Asn భద్రపరచబడింది.N-టెర్మినల్ ప్రైమరీ అమైన్ నైట్రోజన్ UMPకి ఎక్కువగా అంగీకరించేదని మేము విశ్వసిస్తున్నప్పటికీ, N-టెర్మినల్ వద్ద NMP బైండింగ్ యొక్క అదనపు సాక్ష్యాలను పొందాలని మేము నిర్ణయించుకున్నాము.ఈ కారణంగా, HPLC ద్వారా శుద్ధి చేయబడిన NMPylated మరియు NMPylated N- టెర్మినల్ పెప్టైడ్ nsp9 అసిటోన్ మరియు సోడియం సైనోబోరోహైడ్రైడ్ సమక్షంలో తీసుకోబడింది.ఈ పరిస్థితులలో, ప్రొపైల్ (25)తో ఉచిత ప్రాధమిక అమైన్‌లను మాత్రమే సవరించవచ్చు.NNEIMPGK క్రమంతో N-టెర్మినల్ nsp9-ఉత్పన్నమైన పెప్టైడ్ రెండు ప్రాధమిక అమైన్‌లను కలిగి ఉంటుంది, ఒకటి Asn యొక్క N-టెర్మినస్ వద్ద మరియు మరొకటి C-టెర్మినస్ వద్ద Lys యొక్క సైడ్ చెయిన్ వద్ద.అందువల్ల, రెండు చివర్లలో ప్రొపైల్ సమూహాలను ప్రవేశపెట్టవచ్చు.NMPylated కాని పెప్టైడ్‌ల యొక్క సంగ్రహించబడిన అయాన్ క్రోమాటోగ్రామ్‌లు SI అనుబంధం, Figure S5Bలో చూపబడ్డాయి.ఊహించినట్లుగా, N-టెర్మినల్ మరియు C-టెర్మినల్ (మోనో) ప్రొపైలేటెడ్ (SI అనుబంధం, Figure S5B, ఎగువ లేన్) మరియు డిప్రొపైలేటెడ్ పెప్టైడ్‌లు (SI అనుబంధం, Figure S5B, దిగువ లేన్) గుర్తించవచ్చు.nsp9 యొక్క NMPylated N-టెర్మినల్ పెప్టైడ్ వాడకంతో ఈ నమూనా మారుతుంది.ఈ సందర్భంలో, C-టెర్మినల్ ప్రొపైలేటెడ్ పెప్టైడ్‌లను మాత్రమే గుర్తించవచ్చు, అయితే N-టెర్మినల్ ప్రొపైలేటెడ్ పెప్టైడ్‌లు మరియు డిప్రొపైలేటెడ్ పెప్టైడ్‌లు గుర్తించబడవు (SI అనుబంధం, Figure S5C), దీనిని నిరోధించడానికి UMP N-టెర్మినల్ ప్రైమరీ అమైన్‌కు బదిలీ చేయబడిందని సూచిస్తుంది. మార్పులు చేయడం నుండి సమూహం.
తరువాత, లక్ష్య-నిర్దిష్ట పరిమితులను నిర్వచించడానికి nsp9 యొక్క N-టెర్మినస్ వద్ద మేము (Ala లేదా Serతో) భర్తీ చేస్తాము లేదా సంరక్షించబడిన అవశేషాలను తొలగిస్తాము.nsp9 యొక్క N-టెర్మినల్ అవశేషాల యొక్క ప్రాధమిక అమైన్‌తో NiRAN nsp9-NMP వ్యసనాన్ని ఏర్పరుస్తుందని చూపించే మా MS డేటా ఆధారంగా, nsp9 NMPylationకి nsp9 N- టెర్మినల్‌ను విడుదల చేయడానికి వైరల్ మాస్టర్ ప్రోటీజ్ (Mpro, nsp5) అవసరమని మేము ఊహించాము. దాని పాలీప్రొటీన్ పూర్వగామి.ఈ పరికల్పనను పరీక్షించడానికి, మేము E. coliలో nsp9 కలిగిన పూర్వగామి ప్రోటీన్ nsp7-11ని ఉత్పత్తి చేసాము మరియు [α-32P] UTP (పదార్థాలు మరియు పద్ధతులు) సమక్షంలో ప్రామాణిక NMPylation పరీక్షను నిర్వహించాము.మూర్తి 5A (లేన్ 3)లో చూపినట్లుగా, కత్తిరించబడని nsp7-11 పూర్వగామి nsp12తో రేడియోలేబుల్ చేయబడలేదు.దీనికి విరుద్ధంగా, పూర్వగామి నుండి nsp9 (మరియు ఇతర nsps)ని విడుదల చేయడానికి nsp7-11 రీకాంబినెంట్ nsp5 ద్వారా క్లీవ్ చేయబడితే, nsp9తో మైగ్రేట్ చేసే రేడియోలేబుల్ చేయబడిన ప్రోటీన్ కనుగొనబడుతుంది, ఇది NiRAN మరియు N- సమయోజనీయ nsp9-NMP వ్యసనం యొక్క ఎంపికగా ఏర్పడుతుందనే మా నిర్ధారణను నిర్ధారిస్తుంది. .N-టెర్మినల్ Asn యొక్క టెర్మినల్ ప్రైమరీ అమైన్ (pp1a/pp1abలో స్థానం 3825).N- టెర్మినస్ వద్ద ఒకటి లేదా రెండు అదనపు అవశేషాలను కలిగి ఉన్న nsp9 నిర్మాణాన్ని ఉపయోగించే ప్రయోగాల ద్వారా కూడా ఈ నిర్ధారణకు మద్దతు ఉంది.రెండు సందర్భాల్లో, nsp9 యొక్క NiRAN-మధ్యవర్తిత్వ UMPylation రద్దు చేయబడింది (SI అనుబంధం, మూర్తి S7).తరువాత, మేము nsp9 యొక్క N- టెర్మినల్ వద్ద 3825-NNEIMPK-3832 పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్ నుండి తొలగించబడిన ఒకటి లేదా రెండు Asn అవశేషాలతో ప్రోటీన్‌ను ఉత్పత్తి చేసాము.రెండు సందర్భాల్లో, nsp9 UMPylation పూర్తిగా నిరోధించబడింది (Figure 5B), నిజమైన nsp9 N- టెర్మినస్ NMP గ్రాహకంగా పనిచేస్తుందని అదనపు సాక్ష్యాలను అందిస్తుంది.
nsp9 యొక్క ప్రోటీయోలైటిక్ ప్రాసెసింగ్ మరియు nsp12-మధ్యవర్తిత్వ UMPylationలో N-టెర్మినల్ అవశేషాల పాత్ర.(A) nsp9 UMPylationకి ఉచిత nsp9 N-టెర్మినల్ అవసరం.Nsp7-11-His6 రీకాంబినెంట్ Mpro (nsp5-His6) సమక్షంలో లేదా లేకపోవడంతో UTPని కలిగి ఉన్న NMPylation డిటెక్షన్ బఫర్‌లో 30 °C వద్ద ముందుగా పొదిగేది.3 గంటల తర్వాత, మెటీరియల్స్ మరియు మెథడ్స్‌లో వివరించిన విధంగా nsp12-His6ని జోడించడం ద్వారా NMPylation పరీక్షను ప్రారంభించండి.nsp5-His6 (లేన్ 1) మరియు nsp9-His6 (లేన్ 2) కలిగిన ప్రతిచర్య నియంత్రణగా ఉపయోగించబడింది.10 నిమిషాల తర్వాత, ప్రతిచర్య నిలిపివేయబడింది మరియు ప్రతిచర్య మిశ్రమం SDS-PAGE ద్వారా వేరు చేయబడింది.ప్రోటీన్ కూమాస్సీ బ్రిలియంట్ బ్లూ (A, టాప్)తో తడిసినది.Nsp7-11-His6 పూర్వగామి మరియు nsp5-His6 మధ్యవర్తిత్వ క్లీవేజ్ ఫలితంగా ప్రాసెస్ చేయబడిన ఉత్పత్తి కుడివైపున చూపబడ్డాయి.దయచేసి గమనించండి (వాటి చిన్న పరిమాణం కారణంగా) nsp7 మరియు nsp11-His6 ఈ జెల్‌లో గుర్తించబడవు మరియు ప్రతిచర్య nsp5-His6తో అనుబంధంగా ఉంటుంది (లేన్లు 1 మరియు 4; nsp5-His6 స్థానం ఘన వృత్తం ద్వారా సూచించబడుతుంది) లేదా nsp9-His6 (లేన్ 2) చిన్న మొత్తంలో MBP (ఓపెన్ సర్కిల్‌లచే సూచించబడుతుంది) అవశేష మలినాలను కలిగి ఉంటుంది ఎందుకంటే అవి MBP ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌లుగా వ్యక్తీకరించబడతాయి (SI అనుబంధం, టేబుల్ S1).(B) Nsp9-His6 వేరియంట్‌లో ఒకటి లేదా రెండు N-టెర్మినల్ Asn అవశేషాలు లేవు (pp1a/pp1abలోని స్థానం ప్రకారం అవశేషాల సంఖ్య) మరియు nsp12-His6 మరియు [α-32P] UTPతో శుద్ధి చేయబడి, పొదిగేవి.B, Coomassie తో తడిసిన SDS-PAGE ఎగువన చూపబడింది, B, సంబంధిత ఆటోరేడియోగ్రాఫ్ దిగువన చూపబడింది.పరమాణు బరువు మార్కర్ యొక్క స్థానం (కిలోడాల్టన్లలో) ఎడమవైపు చూపబడింది.(సి) HCoV-229E nsp9-His6 N-టెర్మినల్ సంరక్షించబడిన అవశేషాలు Ala లేదా Serతో భర్తీ చేయబడ్డాయి మరియు nsp12-His6 మధ్యవర్తిత్వ UMPylation ప్రతిచర్యలో అదే మొత్తంలో ప్రోటీన్ ఉపయోగించబడింది.ప్రతిచర్య ఉత్పత్తులు SDS-PAGE ద్వారా వేరు చేయబడ్డాయి మరియు కూమాస్సీ బ్రిలియంట్ బ్లూ (C, టాప్)తో స్టెయిన్ చేయబడ్డాయి మరియు రేడియోలేబుల్ చేయబడిన nsp9-His6 ఫాస్ఫోరోసెన్స్ ఇమేజింగ్ (C, మిడిల్) ద్వారా కనుగొనబడింది.వైల్డ్-టైప్ (wt) ప్రోటీన్‌ను సూచనగా (100%కి సెట్ చేయడం) ఉపయోగించి, సాపేక్ష NMPylation కార్యాచరణ (సగటు ± SEM) మూడు స్వతంత్ర ప్రయోగాల నుండి లెక్కించబడుతుంది.(D) HCoV-229E వైల్డ్-టైప్ Huh-7 కణాలతో సోకిన Huh-7 కణాల p1 సెల్ కల్చర్ సూపర్‌నాటెంట్‌లోని వైరస్ టైటర్‌లు మరియు nsp9లో నియమించబడిన అమైనో ఆమ్ల ప్రత్యామ్నాయాలను మోస్తున్న మార్పుచెందగలవారు ఫలకం పరీక్ష ద్వారా నిర్ణయించబడ్డారు.ప్రతిరూపణ-లోపం గల RdRp మూలాంశం C డబుల్ మ్యూటాంట్ DD4823/4AA ప్రతికూల నియంత్రణగా ఉపయోగించబడింది.
nsp9 యొక్క N-టెర్మినస్ (ముఖ్యంగా 1, 2, 3, మరియు 6 స్థానాలు) ఆర్థోకోరోనావిరినే సబ్‌ఫ్యామిలీ (SI అనుబంధం, మూర్తి S6) సభ్యులలో చాలా సంరక్షించబడింది.nsp12-మధ్యవర్తిత్వ nsp9 NMPylationలో ఈ అవశేషాల యొక్క సాధ్యమైన పాత్రను అధ్యయనం చేయడానికి, nsp9 యొక్క N- టెర్మినస్ వద్ద వరుసగా రెండు Asn అవశేషాలు Ala లేదా Ser (ఒంటరిగా లేదా కలయికతో) భర్తీ చేయబడ్డాయి.వైల్డ్-టైప్ nsp9తో పోలిస్తే, N3825ని Ala లేదా Serతో భర్తీ చేయడం వలన nsp12-మధ్యవర్తిత్వ UMPylation రెండు రెట్లు ఎక్కువ తగ్గింది (మూర్తి 5C).N-టెర్మినల్ అవశేషాల సైడ్ చెయిన్‌కు బదులుగా N-టెర్మినల్ ప్రైమరీ అమైన్‌లో NMPylation సంభవిస్తుందని మా నిర్ధారణకు అనుగుణంగా, N3825A మరియు N3825Sల భర్తీతో ముఖ్యమైన అవశేష NMPylationని మేము గమనించాము.ఆసక్తికరంగా, రెండవ Asnని Ala లేదా Serతో భర్తీ చేస్తే, nsp9 UMPylation మరింత బలంగా (10 సార్లు కంటే ఎక్కువ) తగ్గించబడుతుంది, అయితే 3, 4 మరియు 6 స్థానాల్లో Alaని మార్చడం nsp9 UMPylation పై మితమైన ప్రభావాన్ని మాత్రమే కలిగి ఉంటుంది (మూర్తి 2 ) .5C).ATP, CTP లేదా GTP (SI అనుబంధం, మూర్తి S8) ఉపయోగించి ఇలాంటి ఫలితాలు పొందబడ్డాయి.సమిష్టిగా, ఈ డేటా nsp9 NMPylationలో N2826 (nsp9లో స్థానం 2) యొక్క కీలక పాత్రను సూచిస్తుంది.
nsp9 మరియు NMPylation యొక్క N- టెర్మినస్ మధ్య ఫంక్షనల్ కోరిలేషన్ యొక్క అదనపు సాక్ష్యాలను పొందడానికి, మేము కరోనావైరస్ కుటుంబం యొక్క nsp9 సీక్వెన్స్ (104 మరియు 113 అవశేషాల మధ్య మారుతూ ఉంటాయి) యొక్క బహుళ శ్రేణి అమరిక (MSA)ను ప్రదర్శించాము (SI అనుబంధం, మూర్తి S6).మొత్తంగా, వివిధ క్షీరదాలు, పక్షులు మరియు సరీసృపాలు సంక్రమించే ఆర్థోకోరోనావిరినే ఉపకుటుంబంలోని 5 జాతుల 47 (తెలిసిన మరియు పుటేటివ్) జాతులలో, మొత్తం 8 అవశేషాలు మాత్రమే మార్పులేనివిగా గుర్తించబడ్డాయి.మునుపటి నిర్మాణ అధ్యయనాలు (26 ??28) నిర్ణయించినట్లుగా, తొలగింపులు మరియు చొప్పించడంతో సహా అత్యంత విస్తృతమైన మార్పులు nsp9 యొక్క ద్వితీయ నిర్మాణ మూలకాల మధ్య చక్రాలలో గమనించబడ్డాయి.nsp9 యొక్క C-టెర్మినల్ భాగం యొక్క β స్ట్రాండ్ మరియు α హెలిక్స్‌లో ఐదు మార్పులేని అవశేషాలు కనుగొనబడ్డాయి.మూడు మార్పులేని అవశేషాలు nsp9 యొక్క N టెర్మినస్ యొక్క NNE మూలాంశాన్ని ఏర్పరుస్తాయి.ఈ మూలాంశం యొక్క రెండవ అస్న్ మాత్రమే మార్పులేని అవశేషం అని వెల్లడైంది, ఇది సుదూర సంబంధిత కప్ప కరోనావైరస్ యొక్క ఊహాత్మక nsp9 ద్వారా కూడా భాగస్వామ్యం చేయబడింది మరియు ఆల్ఫాలెటోవైరస్ యొక్క ఉపకుటుంబం లెటోవిరినేలోని మైక్రోహైలా లెటోవైరస్ 1 జాతికి ప్రాతినిధ్యం వహిస్తుంది.nsp9 సెకండరీ స్ట్రక్చర్ ఎలిమెంట్స్‌లోని అవశేషాల పరిరక్షణ మడత లేదా తెలిసిన RNA బైండింగ్ లక్షణాలను నిర్వహించడానికి నిర్మాణాత్మక పరిశీలనల ద్వారా హేతుబద్ధీకరించబడుతుంది.అయినప్పటికీ, ఈ తార్కికం NNE పరిరక్షణకు వర్తించదు మరియు ఈ అధ్యయనానికి ముందు, ట్రిపెప్టైడ్ సీక్వెన్స్ యొక్క వైవిధ్యాన్ని పరిమితం చేసే పరిమితుల స్వభావం పూర్తిగా అస్పష్టంగా ఉంది.
కరోనావైరస్ రెప్లికేషన్‌లో nsp9-NMPylation మరియు NNE పరిరక్షణ యొక్క ప్రాముఖ్యతను గుర్తించడానికి, మేము HCoV-229E మార్పుచెందగలవారిని ఉత్పత్తి చేసాము, ఇవి nsp9 N-టెర్మినల్ అవశేషాల యొక్క సింగిల్ లేదా డబుల్ ప్రత్యామ్నాయాలను కలిగి ఉంటాయి, ఇది విట్రోలో nsp9 NMPylation హానికరమని సూచిస్తుంది.మేము ప్రారంభించడానికి ముందు, ఈ ప్రత్యామ్నాయాలు (nsp8|9 క్లీవేజ్ సైట్ దగ్గర) C-టెర్మినల్ pp1a ప్రాంతం యొక్క ప్రోటీయోలైటిక్ ప్రాసెసింగ్‌ను ప్రభావితం చేస్తాయా అనే ప్రశ్నకు సమాధానం ఇవ్వడానికి ప్రయత్నిస్తాము.nsp9 యొక్క N-టెర్మినస్ వద్ద సంబంధిత ప్రత్యామ్నాయాలను కలిగి ఉన్న nsp7-11 పాలీప్రొటీన్ నిర్మాణాల సమితి E. coliలో ఉత్పత్తి చేయబడింది మరియు రీకాంబినెంట్ Mproతో కత్తిరించబడింది.నాలుగు సైట్‌ల (nsp9 ఫ్లాంకింగ్ సైట్‌తో సహా) ప్రోటీయోలైటిక్ క్లీవేజ్‌ను ప్రవేశపెట్టిన ఏవైనా ప్రత్యామ్నాయాలు (SI అనుబంధం, Figure S9) గణనీయంగా ప్రభావితం చేయవు, ఈ ప్రోటీన్‌లలోని నిర్మాణాత్మక మార్పులను మినహాయించి, Mpro-మధ్యవర్తిత్వ nsp8|9 క్లీవేజ్ (లేదా ఇతర) వెబ్సైట్.
Huh-7 కణాలు జన్యు-పొడవు HCoV-229E RNAతో బదిలీ చేయబడ్డాయి, nsp9 N టెర్మినస్ వద్ద సంరక్షించబడిన NNE ట్రిపెప్టైడ్‌లలో (N3825, N3826, మరియు E3827) అలా లేదా సెర్ ప్రత్యామ్నాయాలను ఎన్‌కోడింగ్ చేస్తాయి, చాలా ఉత్పరివర్తనలు ప్రాణాంతకం అని చూపిస్తుంది.N-టెర్మినల్ Asn (N2835A లేదా N2835S) యొక్క Ser లేదా Alaని భర్తీ చేయడం ద్వారా మేము వైరస్‌ను రక్షించగలిగాము, కానీ NNE సీక్వెన్స్‌లో (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, ఇతర సింగిల్ మరియు డబుల్ మ్యుటేషన్‌లతో వైరస్‌ను పునరుద్ధరించడంలో విఫలమయ్యాము. NN3825/6SS) , E3827A) (మూర్తి 5D).
కణజాల సంస్కృతిలో కరోనావైరస్ల ప్రతిరూపం పరిమితం చేయబడిందని ఈ ఫలితాలు సూచిస్తున్నాయి (అదే లేదా ఇలాంటివి), శరీరంలోని nsp9 NMPylation సైట్‌ల సహజ మ్యుటేషన్‌ను పరిమితం చేస్తుంది మరియు కరోనావైరస్ల జీవిత చక్రంలో ఈ ప్రతిస్పందన యొక్క కీలక పాత్రకు మద్దతు ఇస్తుంది.
చివరి ప్రయోగాల సెట్‌లో, మేము SARS-CoV-2 nsp12 మరియు nsp9 లేబుల్ చేయబడిన C-టెర్మినల్ His6 మరియు E. coliలో nsp12 యొక్క రెండు ఉత్పరివర్తన రూపాలను ఉత్పత్తి చేసాము.NiRAN మరియు RdRp డొమైన్‌లలోని క్రియాశీల సైట్ అవశేషాలు వరుసగా Alaను ఉపయోగించాయి (Figure 6A మరియు SI అనుబంధం, టేబుల్ S2).SARS-CoV-2 nsp12లోని K4465, HCoV-229Eలోని K4135కి అనుగుణంగా ఉంటుంది (SI అనుబంధం, మూర్తి S2), ఇది NiRAN కార్యాచరణ మరియు HCoV-229E ప్రతిరూపణకు అవసరమని నిరూపించబడింది (మూర్తి 3D మరియు E).ఈ అవశేషాలు ధమనుల వైరస్ EAV nsp9 K94 అవశేషానికి కూడా అనుగుణంగా ఉంటాయి, ఇది NiRAN స్వీయ-UMPylation/self-GMPylation (16)కి అవసరమని గతంలో చూపబడింది.మూర్తి 6Bలో చూపినట్లుగా, SARS-CoV-2 nsp12 nsp9ని సబ్‌స్ట్రేట్‌గా ఉపయోగించి UMP బదిలీ కార్యాచరణను కలిగి ఉంది, అయితే nsp12_K4465A యాక్టివ్ సైట్ మ్యూటాంట్ నిష్క్రియంగా ఉంది.RdRp మోటిఫ్ C యొక్క SDD లక్షణ శ్రేణిలోని డబుల్ ప్రత్యామ్నాయం UMP బదిలీ కార్యకలాపాన్ని ప్రభావితం చేయదు (మూర్తి 6B), RdRp కార్యాచరణ nsp9 UMPylationలో ప్రత్యక్ష ప్రభావం చూపదని సూచిస్తుంది.CTP, GTP మరియు ATP (SI అనుబంధం, మూర్తి S10) ఉపయోగించి ఇలాంటి డేటా పొందబడింది.సారాంశంలో, ఈ డేటా NiRAN- మధ్యవర్తిత్వ nsp9 NMPylation ఆర్థోకోరోనావైరస్ ఉపకుటుంబంలోని వివిధ జాతులను సూచించే కరోనావైరస్లలో సాంప్రదాయిక కార్యాచరణను కలిగి ఉందని సూచిస్తుంది.
SARS-CoV-2 nsp12-మధ్యవర్తిత్వ NMP9 యొక్క NMPylation.(A) NMPylation పరీక్షలో ఉపయోగించిన రీకాంబినెంట్ ప్రోటీన్‌ను చూపుతున్న కూమాస్సీ స్టెయిన్డ్ SDS-పాలీయాక్రిలమైడ్ జెల్.నియంత్రణగా, SARS-CoV-2 nsp12 యొక్క NiRAN డొమైన్ (K4465A) మరియు RdRp డొమైన్ (DD5152/3AA)లో క్రియాశీల సైట్ ప్రత్యామ్నాయంతో ఉత్పరివర్తన చెందిన ప్రోటీన్ ఉపయోగించబడింది.అవశేషాల సంఖ్య pp1abలో స్థానం ఆధారంగా ఉంటుంది.(B) nsp9-His6 మరియు [α-32P]UTPని nsp12-His6 (వైల్డ్ టైప్ [wt] మరియు మ్యూటాంట్) యొక్క సబ్‌స్ట్రేట్‌గా ఉపయోగించి UMPylation గుర్తింపు యొక్క ఆటోరేడియోగ్రాఫ్.లేబుల్ చేయబడిన ప్రోటీన్ యొక్క పరమాణు ద్రవ్యరాశి (కిలోడాల్టన్లలో) ఎడమవైపు చూపబడింది.
NiRAN డొమైన్‌లు సాధారణంగా Nidovirales (16)లో భద్రపరచబడతాయి, అవి Nidovirus ప్రతిరూపణకు అవసరమైన ఎంజైమాటిక్ ప్రతిచర్యలను ఉత్ప్రేరకపరుస్తాయని సూచిస్తున్నాయి.ఈ అధ్యయనంలో, కరోనావైరస్ యొక్క NiRAN డొమైన్ NMPని (NTP నుండి ఉత్పత్తి చేయబడింది) nsp9కి బదిలీ చేస్తుందని మేము నిరూపించగలిగాము, ఇది వైరస్ రెప్లికేషన్ (26 ?? 29 )లో ప్రమేయం ఉన్న ఒక రహస్యమైన RNA బైండింగ్ ప్రోటీన్, ఇది ఒక సహజ లక్ష్యం మరియు కరోనావైరస్ RTC భాగస్వామి.
NiRAN డొమైన్ మూడు సీక్వెన్స్ మోటిఫ్‌లను (AN, BN మరియు CN) పంచుకుంటుంది, ఇవి మోనోఫైలేటిక్‌లోని అన్ని కుటుంబాలలో భద్రపరచబడిన చాలా తక్కువ సంఖ్యలో అవశేషాలను కలిగి ఉంటాయి, కానీ అత్యంత విభిన్నమైన Nidovirales క్రమంలో (8, 16) .ఇటీవలి అధ్యయనాలు అవి నిర్మాణాత్మకంగా ఎక్కువగా నిర్దేశించబడని ప్రోటీన్ కినేస్ లాంటి ప్రోటీన్ల కుటుంబానికి సంబంధించినవని చూపించాయి, వీటిని మొదట SelO కుటుంబం అని పిలుస్తారు (17, 19, 22, 30, 31).SelO- సంబంధిత ప్రోటీన్లు కినేస్ మడతలు కలిగి ఉంటాయి, అయితే క్లాసికల్ కినాసెస్‌లో (22, 32) అనేక సంరక్షించబడిన క్రియాశీల సైట్ అవశేషాలు లేవు.సక్రియ సైట్‌కు కట్టుబడి మరియు నిర్దిష్ట పరస్పర చర్యల ద్వారా స్థిరీకరించబడిన ATP అణువుల రివర్స్ ఓరియంటేషన్ ఆధారంగా, SelO పరికల్పన చేయబడింది మరియు తరువాత AMP (ఫాస్ఫేట్‌కు బదులుగా) ప్రోటీన్ సబ్‌స్ట్రేట్ (22)కి బదిలీ చేయబడుతుందని నిర్ధారించబడింది, అయితే మరొక బ్యాక్టీరియా SelO లాంటి ప్రోటీన్ YdiU కలిగి ఉంది. ఇటీవల టైర్‌కు UMP యొక్క సమయోజనీయ అనుబంధాన్ని మరియు వివిధ ప్రోటీన్ సబ్‌స్ట్రేట్‌ల యొక్క అతని అవశేషాలను ఉత్ప్రేరకపరచడానికి చూపబడింది (33).
కరోనావైరస్ NiRAN డొమైన్ యొక్క పుటేటివ్ యాక్టివ్ సైట్ అవశేషాల అంచనాను నిర్ధారించడానికి మరియు విస్తరించడానికి, మేము కరోనావైరస్ nsp12 (Figure 3D మరియు E మరియు SI అనుబంధం, Figure S3 మరియు టేబుల్) S1â పై మ్యుటేషన్ విశ్లేషణ చేయడానికి బయోకెమికల్ మరియు రివర్స్ జెనెటిక్స్ పద్ధతులను ఉపయోగించాము. S4).HCoV-229E K4135, R4178 మరియు D4280లను అలాతో భర్తీ చేయడం వలన విట్రో NMP ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ యాక్టివిటీ మరియు సెల్ కల్చర్‌లో వైరస్ రెప్లికేషన్‌ను తొలగిస్తుందని డేటా చూపిస్తుంది (మూర్తి 3D మరియు E మరియు SI అనుబంధాలు, Figure S3), NTP γ-ఫాస్ఫేట్‌లో వాటి ఉనికికి మద్దతు ఇస్తుంది. (K4135, R4178) మరియు క్రియాశీల సైట్ మెటల్ అయాన్ల సమన్వయం (D4280).K4135 (17) స్థానాన్ని స్థిరీకరించడానికి అంచనా వేసిన పక్షుల గూడు వైరస్ పరిధిలోని సంరక్షించబడిన గ్లూ యొక్క E4145A ప్రత్యామ్నాయం వైరల్ రెప్లికేషన్‌ను తొలగించడానికి చూపబడింది, అయితే ఆశ్చర్యకరంగా, ఈ చర్య ఇన్ విట్రో NMPylation పరీక్షలో ఉంచబడింది (మూర్తి 3D మరియు E మరియు SI అనుబంధం, మూర్తి S3 మరియు పట్టికలు S1-S4).సాల్మోనెల్లా టైఫిమూరియం (E130A) (33) యొక్క YdiU హోమోలాగ్‌లో సంబంధిత ప్రత్యామ్నాయాన్ని ప్రవేశపెట్టినప్పుడు ఇదే విధమైన పరిశీలన చేయబడింది.కలిసి తీసుకుంటే, ఈ డేటా ఉత్ప్రేరక పనితీరు కంటే ఈ సంరక్షించబడిన అవశేషాల నియంత్రణ పనితీరుకు మద్దతు ఇస్తుంది.
HCoV-229E NiRAN డొమైన్ (8)లో నెస్టోవైరస్ పరిధిలో సంరక్షించబడిన Phe అవశేషాలను (F4281A) భర్తీ చేయడం వల్ల విట్రోలో NMPylation కార్యాచరణ తగ్గింది మరియు సెల్ కల్చర్‌లో వైరస్ రెప్లికేషన్ గణనీయంగా తగ్గింది (మూర్తి 3D, E మరియు SI) అనుబంధం, మూర్తి S3).గతంలో చూపిన హోమోలాగస్ DFG మూలాంశం Phe అవశేషం వంటి ఈ అవశేషాల యొక్క ముఖ్యమైన నియంత్రణ విధికి డేటా స్థిరంగా ఉంటుంది.క్లాసికల్ ప్రోటీన్ కినాసెస్‌లో, ఇది Mg2+ బైండింగ్ లూప్‌లో భాగం మరియు వెన్నెముకను సమీకరించడానికి మరియు నియంత్రించడంలో సహాయపడుతుంది???సమర్థవంతమైన ఉత్ప్రేరక చర్య కోసం అవసరం (32, 34).Ala మరియు Argని K4116 అవశేషాలకు ప్రత్యామ్నాయం చేయడం (ప్రీఎన్ మోటిఫ్‌లో) వరుసగా, వైరల్ రెప్లికేషన్‌ను తొలగించింది మరియు ఊహించినట్లుగా, ప్రవేశపెట్టిన అమైనో యాసిడ్ సైడ్ చైన్‌పై ఆధారపడి విట్రోలో NMP ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ యాక్టివిటీపై విభిన్న ప్రభావాలను కలిగి ఉంది (మూర్తి 3D మరియు E మరియు SI అనుబంధాలు , మూర్తి S3).ఫంక్షనల్ డేటా నిర్మాణాత్మక సమాచారానికి అనుగుణంగా ఉంటుంది, ఈ అవశేషాలు ATP ఫాస్ఫేట్ (17)తో పరస్పర చర్యను ఏర్పాటు చేసిందని సూచిస్తుంది.ఇతర సమూహ వైరస్ కుటుంబాల NiRAN డొమైన్‌లో, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 యొక్క స్థానం Lys, Arg లేదా అతని (8)చే ఆక్రమించబడింది, ఈ నిర్దిష్ట అవశేషాల యొక్క క్రియాత్మక పరిమితి సడలించబడిందని సూచిస్తుంది.D4188A మరియు D4283A యొక్క ప్రత్యామ్నాయం ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలను తొలగిస్తుంది లేదా బలంగా తగ్గిస్తుంది మరియు వైరస్ ప్రతిరూపణను తొలగిస్తుంది (మూర్తి 3).ఈ రెండు అవశేషాలు చాలా (కానీ అన్నీ కాదు) సమూహ వైరస్‌లలో (8) భద్రపరచబడ్డాయి, ఇది ఒక ముఖ్యమైన కుటుంబ-నిర్దిష్ట కానీ బహుశా ఉత్ప్రేరక రహిత పనితీరును సూచిస్తుంది.అనేక ఇతర Lys మరియు Asp అవశేషాల (K4113A, D4180A, D4197A మరియు D4273A) యొక్క Ala ప్రత్యామ్నాయాలు కరోనావిరిడే లేదా ఇతర Nestioviridae కుటుంబాలలో (8) సంరక్షించబడనివి నియంత్రణలుగా ఉపయోగించబడ్డాయి.ఊహించినట్లుగా, ఈ ప్రత్యామ్నాయాలు చాలా వరకు సహించదగినవి, కొన్ని సందర్భాల్లో ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలు మరియు వైరల్ రెప్లికేషన్‌లో స్వల్ప తగ్గుదల (మూర్తి 3 మరియు SI అనుబంధం, మూర్తి S3).మొత్తంమీద, కరోనావైరస్ మ్యూటాజెనిసిస్ డేటా EAV NiRAN-RdRp (16) యొక్క స్వీయ-GMP మరియు రివర్స్ జెనెటిక్స్ డేటాతో చాలా స్థిరంగా ఉంటుంది, దీనిలో EAV nsp9 (కరోనావైరస్ nsp12 ఆర్థోలాగ్) అవశేషాలు K94 (HCoV- 229E K4135కి అనుగుణంగా) ముఖ్యమైన విధులు. R124 (R4178కి సంబంధించినది), D132 (D4188కి సంబంధించినది), D165 (D4280కి సంబంధించినది), F166 (F4281కి సంబంధించినది).అదనంగా, HCoV-229E మ్యూటాజెనిసిస్ డేటా గతంలో నివేదించబడిన SARS-CoV రివర్స్ జెనెటిక్స్ డేటా (16)కి అనుగుణంగా మరియు విస్తరించబడింది, సంబంధిత CN మూలాంశం Phe-to-Ala ఉత్పరివర్తన SARS-CoV_nsp12 కోసం గమనించిన వాటికి చాలా పోలి ఉంటుంది. ఫినోటైప్ వివరించబడింది -F219A మరియు HCoV-229E_F4281A (మూర్తి 3 D మరియు E మరియు SI అనుబంధం, మూర్తి S3 మరియు టేబుల్ S1-S4).
UTP మరియు GTP (స్వీయ-NMPylation ప్రతిచర్యలో)లకు స్పష్టమైన ప్రాధాన్యత కలిగిన EAV ఆర్థోలాగ్‌లతో (16) పోలిస్తే, మా అధ్యయనం కరోనావైరస్ NiRAN డొమైన్ (HCoV-229E మరియు SARS-CoV-2 ద్వారా ప్రాతినిధ్యం వహిస్తుంది) ప్రభావవంతంగా ఉంటుందని చూపిస్తుంది. మొత్తం నాలుగు NMPలను బదిలీ చేసింది, అయినప్పటికీ UMPకి కొంచెం ప్రాధాన్యత ఉంది (గణాంకాలు 1 మరియు 3).నిర్దిష్ట NTP సహ-సబ్‌స్ట్రేట్ యొక్క సాపేక్షంగా తక్కువ నిర్దిష్టత ఇటీవల నివేదించబడిన SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 సూపర్ కాంపోజిట్ స్ట్రక్చర్‌కు అనుగుణంగా ఉంటుంది, దీనిలో ADP-Mg2+ NiRAN యొక్క క్రియాశీల సైట్‌తో బంధిస్తుంది, కానీ అడెనైన్ పార్ట్‌తో కాదు. నిర్దిష్ట పరస్పర చర్యల ఏర్పాటు (17).మా అధ్యయనంలో, NMPylation ప్రతిచర్యలో ఉపయోగించే న్యూక్లియోటైడ్ రకం ఉత్పరివర్తన ప్రోటీన్ (SI అనుబంధం, Figure S3) యొక్క కార్యాచరణపై ఎటువంటి అవకలన ప్రభావాన్ని చూపదు, ఈ అవశేషాలు ఏవీ నిర్దిష్ట న్యూక్లియోబేస్ యొక్క బైండింగ్‌తో దగ్గరి సంబంధం కలిగి లేవని సూచిస్తుంది.కరోనా వైరస్‌లు మరియు ధమనుల వైరస్‌ల యొక్క NiRAN డొమైన్‌లలో గమనించిన విభిన్న NTP కో-సబ్‌స్ట్రేట్ ప్రాధాన్యతల యొక్క నిర్మాణాత్మక ఆధారం మరియు సంభావ్య జీవసంబంధ ప్రాముఖ్యతను అధ్యయనం చేయాల్సి ఉంది;అవి నిజం కావచ్చు లేదా వారి సంబంధిత అధ్యయనాల పరిమితుల వల్ల కావచ్చు.ప్రస్తుతానికి, ధమనుల వైరస్ NiRAN డొమైన్ యొక్క సంభావ్య NMPylator కార్యాచరణ (గతంలో వర్గీకరించబడిన స్వీయ-NMPylation కార్యాచరణతో పోలిస్తే) వేరొక సహ-ఉపరితల ప్రాధాన్యతను కలిగి ఉంది, ధమని మరియు కరోనావైరస్ మధ్య సారూప్యతను పరిగణనలోకి తీసుకుంటుంది. NiRAN డొమైన్ దాని పరిమితిలో ఉంది.సీక్వెన్స్-బేస్డ్ కంపేర్ (16).Mg2+ని కోఫాక్టర్‌గా ఉపయోగించే సూడోకినేస్ SelOతో పోలిస్తే, కరోనావైరస్ మరియు ధమనుల వైరస్ NiRAN యొక్క కార్యాచరణ Mn2+ (16)పై ఆధారపడి ఉంటుంది (మూర్తి 3C మరియు SI అనుబంధం, మూర్తి S1).Mn2+ ఆధారపడటం మరియు UTP కోసం స్పష్టమైన ప్రాధాన్యత అనేది ప్రోటీన్ NMPylators యొక్క అసాధారణ లక్షణం, మరియు ఇది ఇటీవలే సాల్మొనెల్లా టైఫిమూరియం యొక్క YdiU ప్రోటీన్‌లో నిర్ధారించబడింది, ఇది స్ట్రెస్ ఇండక్షన్ సెల్ ATP పూల్ నుండి కణాలను రక్షించడానికి కఠినమైన Mn2+-ఆధారిత ప్రోటీన్ చాపెరోన్ UMPylationను ఉత్ప్రేరకపరుస్తుంది. 33)
కరోనావైరస్ NiRAN డొమైన్ మరియు సెల్యులార్ ప్రోటీన్ కినాసెస్ (17, 19) మధ్య ఇటీవల వివరించిన నిర్మాణ సారూప్యత, ఈ అధ్యయనంలో మేము నివేదించిన ఇతర ప్రోటీన్‌లకు NMPని సమయోజనీయంగా లింక్ చేసే NiRAN సామర్థ్యానికి అదనపు మద్దతును అందిస్తుంది.మేము HCoV-229E ORF1a ద్వారా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన ప్రోటీన్‌లపై సాధ్యమయ్యే NiRAN లక్ష్యాల కోసం మా శోధనను కేంద్రీకరించాము, ఇవి RTC యొక్క ORF1b-ఎన్‌కోడ్ చేసిన ప్రతిరూపానికి ప్రత్యక్షంగా లేదా పరోక్షంగా సహాయపడతాయి (12, 35).మా ప్రయోగాలు nsp9 యొక్క ప్రభావవంతమైన మరియు నిర్దిష్టమైన NMPylation కోసం నిశ్చయాత్మకమైన సాక్ష్యాలను అందిస్తాయి (మూర్తి 2).ఎంజైమ్ (nsp12) కంటే 8 నుండి 10 రెట్లు అధికంగా ఉండే మోలార్‌లో టార్గెట్ ప్రొటీన్‌ని ఉపయోగించినట్లయితే, nsp9 పూర్తిగా (మోనో)NMP చేయబడినట్లు నిర్ధారించబడింది (మూర్తి 4).nsp12 మరియు nsp9 మధ్య పరస్పర చర్య స్వల్పకాలికంగా ఉంటుందని మరియు nsp9 (ఇతర RTC సబ్‌యూనిట్‌లు లేనప్పుడు)తో స్థిరమైన కాంప్లెక్స్‌ను ఏర్పరచదని మేము నిర్ధారించాము.SARS-CoV ప్రోటీమ్ (35)పై ప్రోటీన్ ఇంటరాక్షన్ అధ్యయనాల ద్వారా ఈ నిర్ధారణకు మద్దతు ఉంది.MS విశ్లేషణ nsp9 యొక్క N- టెర్మినల్ అవశేషాల యొక్క ప్రాధమిక అమైన్‌ను NMPylation సైట్‌గా గుర్తించింది (SI అనుబంధం, Figure S5).ఫాస్ఫోరామిడేట్ బంధం మరియు N-టెర్మినల్ అమైనో సమూహం ఏర్పడటం వలన NiRAN-మధ్యవర్తిత్వ NMPylation చర్యను సూడోమోనాస్ సిరింగే SelO-మధ్యవర్తిత్వ AMPylation ప్రతిచర్య నుండి వేరు చేస్తుంది, ఇది Ser, Thr లేదా Tyr అవశేషాల వద్ద O-లింక్డ్ AMP ఏర్పడటానికి ఉత్ప్రేరకమవుతుంది. 22), మరియు S. టైఫిమూరియం YdiU O-లింక్డ్ (టైర్‌తో) మరియు N- లింక్డ్ (అతనితో) పెప్టైడ్-UMP అడక్ట్‌లను ఏర్పరుస్తుంది.ప్రోటీన్ల యొక్క SelO కుటుంబంపై అందుబాటులో ఉన్న పరిమిత సమాచారం ఈ పెద్ద ప్రోటీన్ కుటుంబంలోని సభ్యులు పెప్టైడ్-NMP వ్యసనాల ఏర్పాటులో చాలా తేడా ఉందని సూచిస్తుంది.ఇది మరింత అధ్యయనానికి అర్హమైన ఆసక్తికరమైన పరిశీలన.
ఈ అధ్యయనంలో పొందిన డేటా, nsp9 యొక్క NMPylationకి ఉచిత N- టెర్మినస్ అవసరమని ఊహించడానికి మాకు దారితీసింది.వైరల్ రెప్లికేషన్ సందర్భంలో, ఇది Mpro మరియు pp1ab మధ్యవర్తిత్వం వహించిన రెప్లికేస్ పాలీప్రొటీన్ pp1aలో nsp8|nsp9 ప్రాసెసింగ్ సైట్ యొక్క ప్రోటీయోలైటిక్ క్లీవేజ్ ద్వారా అందించబడుతుంది.చాలా కరోనావైరస్లలో, ఈ నిర్దిష్ట సైట్ (VKLQ|HCoV-229Eలో NNEI) మరియు అన్ని ఇతర కరోనావైరస్ Mpro క్లీవేజ్ సైట్‌ల మధ్య వ్యత్యాసం Asn (అలా, సెర్ లేదా గ్లై వంటి మరొక చిన్న అవశేషాల కంటే) P1âని ఆక్రమించాలా???స్థానం (36).ప్రారంభ అధ్యయనాలలో పొందిన పెప్టైడ్ క్లీవేజ్ డేటా nsp8|nsp9 సైట్ యొక్క క్లీవేజ్ సామర్థ్యం ఇతర సైట్‌ల కంటే తక్కువగా ఉందని చూపింది, 1) ఈ నిర్దిష్ట సైట్ C-టెర్మినల్ యొక్క సకాలంలో సమన్వయ ప్రాసెసింగ్‌లో నియంత్రణ పాత్రను కలిగి ఉండవచ్చని సూచిస్తుంది. pp1a ప్రాంతం, లేదా 2) a వైరస్ రెప్లికేషన్‌లో ప్రత్యేక సంరక్షించబడిన nsp9 N-టెర్మినస్ పాత్ర (37).మా డేటా (Figure 5A) నిజమైన N-టెర్మినల్ సీక్వెన్స్‌ను కలిగి ఉన్న nsp9 యొక్క రీకాంబినెంట్ రూపం nsp12 ద్వారా సమర్థవంతంగా NMP చేయబడిందని చూపించింది.ఫ్యాక్టర్ Xa (nsp9-His6; SI అనుబంధం, టేబుల్ S1) లేదా Mpro-మెడియేటెడ్ క్లీవేజ్ (nsp7-11-His6; ఫిగర్ 5A మరియు SI అనుబంధం, టేబుల్ S1) ద్వారా N-టెర్మినల్ ఫ్లాన్కింగ్ సీక్వెన్స్ తీసివేయబడింది.ముఖ్యముగా, అన్‌కట్ nsp9-కలిగిన పూర్వగామి nsp7-11-His6 nsp12 యొక్క NMPylationకు ప్రతిఘటనను చూపించింది, ఇది మా డేటాకు అనుగుణంగా ఉంటుంది, ఇది N-టెర్మినల్ ప్రైమరీ అమైన్ (SI అనుబంధం, Figure S5) ద్వారా nsp9-NMP అడక్ట్ ఏర్పడిందని సూచిస్తుంది. .NiRAN సబ్‌స్ట్రేట్ విశిష్టత గురించి లోతైన అవగాహన పొందడానికి, మేము nsp9 యొక్క ప్రక్కనే ఉన్న N- టెర్మినల్ అవశేషాలపై దృష్టి సారించాము.ఇతర ప్రోటీన్లు లేనప్పుడు, అవి నిర్మాణాత్మకంగా అనువైనవి, nsp9 (26 28, 38) యొక్క లేబుల్ చేయని రూపంలో గుర్తించబడకుండా నిరోధిస్తుంది, వాటి పరిమిత సహజ వైవిధ్యాన్ని సూచిస్తుంది, ఇది ముఖ్యమైన క్రమం-నిర్దిష్ట (ద్వితీయ నిర్మాణానికి సంబంధించినది కాదు) nsp9 N-టెర్మినల్ ఫ్రాగ్మెంట్ యొక్క ఫంక్షన్.ఈ ప్రాంతంలోని సంరక్షించబడిన అవశేషాల యొక్క Ala ప్రత్యామ్నాయాలు (గణాంకాలు 5C మరియు D మరియు SI అనుబంధం, Figure S8) విట్రోలో nsp9 NMPylation కోసం N3826 అవసరమని వెల్లడిస్తుంది, అయితే N3825A మరియు E3827A ప్రత్యామ్నాయాలు NMPylation తగ్గడానికి దారితీస్తాయి, అయితే M3820A మరియు P3820A ప్రత్యామ్నాయాలు తగ్గవు. .సహజంగానే nsp9 NMPylation ప్రభావితం చేస్తుంది.N-టెర్మినల్ Asn (N3825A, N3825S) యొక్క ప్రత్యామ్నాయం nsp9 NMPylation మరియు సెల్ కల్చర్‌లో వైరస్ రెప్లికేషన్ (Figure 5C మరియు D)పై ఒక మోస్తరు ప్రభావాన్ని మాత్రమే కలిగి ఉన్నప్పటికీ, N-టెర్మినల్ 3825-NN డైపెప్టైడ్ నుండి Asn అవశేషాల క్రమం యొక్క తొలగింపు ఇది వైరస్‌లకు ప్రాణాంతకం అని నిరూపించబడింది, ఇది N- టెర్మినస్‌లో మరొక అవశేషానికి ముందు ఒక Asn అవశేషం అవసరమని సూచిస్తుంది, ప్రాధాన్యంగా Asn, అయితే సారూప్య అవశేషాల ప్రత్యామ్నాయాన్ని పాక్షికంగా తట్టుకోవచ్చని తెలుస్తోంది (మూర్తి 5B, C, మరియు D).మేము 3825-NN డైపెప్టైడ్, ముఖ్యంగా కరోనావైరస్ పరిధిలోని సంరక్షించబడిన మరియు అవసరమైన N3826 అవశేషాలు (SI అనుబంధం, Figure S6), NiRAN యొక్క క్రియాశీల సైట్‌లో nsp9 N-టెర్మినస్ యొక్క సరైన బైండింగ్ మరియు విన్యాసాన్ని నిర్ధారిస్తుంది.
అన్ని ఉపకుటుంబాల సంరక్షించబడిన గ్లూ కోసం Ala (E3827A)ని భర్తీ చేయడం వలన విట్రోలో nsp9 NMPylation ఉంటుంది, అయితే సెల్ కల్చర్‌లో వైరస్‌లకు ప్రాణాంతకం (Figure 5C మరియు D), ఈ అవశేషాల అదనపు పనితీరును సూచిస్తుంది, ఉదాహరణకు, కీలక పరస్పర చర్యలలో (NMPylated లేదా unmodified ) nsp9 N- టెర్మినస్ మరియు వైరస్ రెప్లికేషన్‌లో పాల్గొన్న ఇతర అంశాలు.Nsp9 ఉత్పరివర్తనలు nsp9 లేదా ఏదైనా ప్రక్కనే ఉన్న nsps (39) యొక్క ప్రోటీయోలైటిక్ ప్రక్రియను ప్రభావితం చేయలేదు (SI అనుబంధం, Figure S9), గమనించిన అనేక nsp9 ఉత్పరివర్తనాల యొక్క ప్రాణాంతక సమలక్షణాలు C ప్రోటీయోలైటిక్ ప్రాసెస్-టెర్మినల్ pp1a ప్రాంతం యొక్క క్రమబద్ధీకరణ వల్ల సంభవించలేదని సూచిస్తుంది. .
pp1a/pp1abలో nsp8|9 క్లీవేజ్ సైట్ యొక్క Mpro-మధ్యవర్తిత్వ చికిత్స తర్వాత, nsp9 యొక్క N-టెర్మినస్ UMPylated (లేదా మరొక NMPతో పాక్షికంగా సవరించబడుతుంది) అని పై డేటా రుజువుని అందిస్తుంది.అదనంగా, nsp9 యొక్క N- టెర్మినస్ (కరోనావైరస్ కుటుంబంలోని ఏకవచన మరియు మార్పులేని Asn అవశేషాలతో సహా) యొక్క అద్భుతమైన పరిరక్షణ మరియు ఈ అధ్యయనంలో పొందిన రివర్స్ జెనెటిక్స్ డేటా (గణాంకాలు 3E మరియు 5D) వివరించిన nsp9 NMPylation అని నిర్ధారించడానికి మాకు దారితీసింది. బయోలాజికల్ గా సంబంధించినది మరియు కరోనావైరస్ రెప్లికేషన్ కోసం అవసరం.ఈ సవరణ యొక్క క్రియాత్మక పరిణామాలు అధ్యయనం చేయవలసి ఉంది, ఉదాహరణకు, గతంలో వివరించిన (నాన్-స్పెసిఫిక్) nsp9 (మార్పు చేయని రూపం) RNA బైండింగ్ కార్యాచరణ (2628).N-టెర్మినల్ NMPylation ప్రోటీన్ లేదా RNA సబ్‌స్ట్రేట్‌లతో nsp9 యొక్క పరస్పర చర్యను లేదా వివిధ నాలుగు-స్థాయి సమావేశాల ఏర్పాటును కూడా ప్రభావితం చేయవచ్చు.ఇవి స్ట్రక్చరల్ స్టడీస్‌లో గమనించబడ్డాయి మరియు కొరోనావైరస్ రెప్లికేషన్‌కు క్రియాత్మకంగా సంబంధించినవిగా నిర్ధారించబడ్డాయి, అయితే ముఖ్యంగా ఈ సవరణ విషయంలో లేనప్పటికీ (26- ââ29, 40).
కరోనావైరస్ NiRAN డొమైన్ యొక్క లక్ష్య విశిష్టతను ఇంకా మరింత వివరంగా వివరించాల్సిన అవసరం ఉన్నప్పటికీ, కరోనావైరస్ NiRAN డొమైన్ యొక్క ప్రోటీన్ లక్ష్య విశిష్టత చాలా ఇరుకైనదని మా డేటా చూపిస్తుంది.అన్ని నిడోవైరస్ కుటుంబాల యొక్క NiRAN డొమైన్‌లో కీలకమైన క్రియాశీల సైట్ అవశేషాల పరిరక్షణ (8, 16) సంరక్షించబడిన NMPylator ఈ ప్రొటీన్‌ల కార్యాచరణకు బలంగా మద్దతు ఇస్తున్నప్పటికీ, ఈ డొమైన్ పరిరక్షణ మరియు పరిరక్షణ యొక్క సబ్‌స్ట్రేట్ బైండింగ్ పాకెట్ అవశేషాల గుర్తింపు వర్గీకరించబడాలి. , మరియు Nidovirales ప్రయోజనాల యొక్క వివిధ కుటుంబాల మధ్య తేడా ఉండవచ్చు.అదేవిధంగా, ఇతర సమూహ వైరస్‌ల సంబంధిత లక్ష్యాలు ఇంకా నిర్ణయించబడలేదు.అవి nsp9 లేదా ఇతర ప్రొటీన్‌ల యొక్క రిమోట్ ఆర్థోలాగ్‌లు కావచ్చు, ఎందుకంటే సాధారణంగా సమూహ వైరస్‌లలో సంరక్షించబడిన ఐదు రెప్లికేస్ డొమైన్‌ల వెలుపల ఉన్న సీక్వెన్సులు తక్కువగా సంరక్షించబడతాయి (8), Mpro మరియు NiRAN మధ్య జన్యు శ్రేణితో సహా, వాటిలో, nsp9 లో ఉంది కరోనా వైరస్.
అదనంగా, NiRAN డొమైన్ అదనపు (సెల్యులార్‌తో సహా) లక్ష్యాలను కలిగి ఉండే అవకాశాన్ని మేము ప్రస్తుతం తోసిపుచ్చలేము.ఈ సందర్భంలో, ఈ ఉద్భవిస్తున్న ప్రోటీన్ NMPylators (NMPylators) (30, 31) లోని బాక్టీరియల్ హోమోలాగ్‌లు “మాస్టర్ రెగ్యులేటర్‌లు” ఉన్నట్లు పేర్కొనడం విలువైనదేనా?NMP వివిధ రకాల సెల్యులార్ ప్రోటీన్లను వాటి దిగువ కార్యకలాపాలను నియంత్రించడానికి లేదా తొలగించడానికి మాడ్యులేట్ చేస్తుంది, తద్వారా సెల్యులార్ స్ట్రెస్ రెస్పాన్స్ మరియు రెడాక్స్ హోమియోస్టాసిస్ (22, 33) వంటి వివిధ జీవ ప్రక్రియలలో పాత్ర పోషిస్తుంది.
ఈ అధ్యయనంలో (గణాంకాలు 2 మరియు 4 మరియు SI అనుబంధం, గణాంకాలు S3 మరియు S5), nsp12 UMP (NMP) భాగాన్ని nsp9లో ఒకే (సంరక్షించబడిన) స్థానానికి బదిలీ చేసిందని మేము నిరూపించగలిగాము, అయితే ఇతర ప్రోటీన్లు దీనిలో సవరించబడలేదు. పరిస్థితులలో ఉపయోగించబడుతుంది, బాగా నిర్వచించబడిన (వదులుగా కాకుండా) సబ్‌స్ట్రేట్ విశిష్టతకు మద్దతు ఉంది.దీనికి అనుగుణంగా, N-టెర్మినల్ nsp9 NMPylationతో పోలిస్తే, nsp12′ స్వంత NMPylation కార్యాచరణ చాలా తక్కువగా ఉంటుంది, దాని గుర్తింపుకు ఎక్కువ ఆటోరాడియోగ్రఫీ ఎక్స్‌పోజర్ సమయం అవసరం మరియు nsp12 ఏకాగ్రతలో 10 రెట్లు పెరుగుదల ఉపయోగించబడుతుంది.అదనంగా, మా MS విశ్లేషణ nsp12 యొక్క NMPylation కోసం సాక్ష్యాలను అందించడంలో విఫలమైంది, ఇది NiRAN డొమైన్ స్వీయ-NMPylation (ఉత్తమంగా) ద్వితీయ కార్యాచరణ అని సూచిస్తుంది.అయినప్పటికీ, ఇతర అధ్యయనాలు బ్యాక్టీరియా NMPylator యొక్క స్వీయ-AMPylation స్థితి ఇతర ప్రోటీన్ ఉపరితలాలపై (22, 33) వారి NMPylation కార్యాచరణను నియంత్రించవచ్చని ప్రాథమిక సాక్ష్యాలను అందించాయని గమనించాలి.అందువల్ల, C-టెర్మినల్ RdRp డొమైన్ మడతపై ప్రతిపాదిత చాపెరోన్ లాంటి ప్రభావంతో సహా, EAV nsp9 (16) మరియు కరోనావైరస్ nsp12 (ఈ అధ్యయనం) కోసం నివేదించబడిన స్వీయ-NMPylation కార్యకలాపాల యొక్క సాధ్యమయ్యే క్రియాత్మక ప్రభావాలను పరిశోధించడానికి మరింత పరిశోధన అవసరం. 16)).
గతంలో, RNA లిగేస్, RNA-క్యాప్డ్ గ్వానైలేట్ ట్రాన్స్‌ఫేరేస్ మరియు ప్రోటీన్ ప్రైమింగ్ యాక్టివిటీ (16)తో సహా నిడోవైరల్ NiRAN డొమైన్ యొక్క దిగువ ఫంక్షన్‌లకు సంబంధించి అనేక పరికల్పనలు పరిగణించబడ్డాయి, అయితే వాటిలో ఏవీ అందుబాటులో ఉన్న దిగువ ఫంక్షన్‌లకు అనుకూలంగా లేవు.కింది స్థానాల్లో పొందిన సమాచారం అదనపు అంచనాలు లేకుండా సరిగ్గా అదే సమయంలో ఉంటుంది.ఈ అధ్యయనంలో పొందిన డేటా, ప్రోటీన్-ప్రేరిత RNA సంశ్లేషణ ప్రారంభంలో NiRAN డొమైన్ పాల్గొంటుందని (కానీ నిరూపించలేము) చాలా స్థిరంగా ఉంటుంది.5లో NiRAN డొమైన్ ఫంక్షన్ అని గతంలో నమ్మేవారు.²-RNA క్యాపింగ్ లేదా RNA లిగేషన్ రియాక్షన్‌లు ఇవి మరియు ఇతర డేటా యొక్క మద్దతు ద్వారా ప్రభావితం కావు.కాబట్టి, ఉదాహరణకు, NiRAN యొక్క సక్రియ సైట్ సాధారణ స్థావరంగా సంరక్షించబడిన Aspని కలిగి ఉన్నట్లు పరిగణించబడుతుంది (సూడోమోనాస్ సిరింగే SelOలో D252; HCoV-229E pp1abలో D4271; SARS-CoV-2 nsp12లో D208) (SI అనుబంధం 2, చిత్రం 2 )S2) (17, 22, 33), అయితే ATP-ఆధారిత RNA లిగేస్ మరియు RNA క్యాపింగ్ ఎంజైమ్‌లో ఉత్ప్రేరకాన్ని సమయోజనీయ ఎంజైమ్-(లైసిల్-N)-NMP ఇంటర్మీడియట్ నిర్వహిస్తుంది, ఇందులో మార్పు చెందని లైస్ అవశేషాలు ( 41)అదనంగా, సంరక్షించబడిన ప్రోటీన్ లక్ష్యాల కోసం కరోనావైరస్ NiRAN యొక్క విశేషమైన సీక్వెన్స్-ఆధారిత విశిష్టత మరియు NTP సహ-సబ్‌స్ట్రేట్‌ల కోసం రిలాక్స్డ్ స్పెసిసిటీ (UTPని ఇష్టపడుతుంది) NiRAN-మధ్యవర్తిత్వ క్యాపింగ్ ఎంజైమ్ లేదా RNA లిగేస్ లాంటి ఫంక్షన్‌లను వ్యతిరేకిస్తుంది.
సహజంగానే, ధృవీకరించడానికి మరియు నిరూపించబడినట్లయితే, ప్రోటీన్-ప్రేరిత RNA సంశ్లేషణలో nsp9-UMP (nsp9-NMP) యొక్క సాధ్యమైన పాత్రను వివరించడానికి చాలా అదనపు పని అవసరం, ఇది గతంలో నివేదించబడిన అనేక ఆసక్తికరమైన కానీ (ఇప్పటి వరకు) నివేదికలను కనెక్ట్ చేస్తుంది. .వివిక్త పరిశీలనలు.ఉదాహరణకు, కరోనావైరస్ యొక్క నెగటివ్-స్ట్రాండ్ RNA ముగింపు ఒలిగో(U) స్ట్రాండ్ (42, 43)తో మొదలవుతుందని నిర్ధారించబడింది.ఈ పరిశీలన నెగటివ్-స్ట్రాండ్ RNA యొక్క సంశ్లేషణ nsp9 యొక్క UMPylated రూపాన్ని పాలీ(A) టెయిల్ (ట్రిగ్గర్స్)కి బంధించడం ద్వారా ప్రారంభించబడుతుందనే ఆలోచనకు అనుగుణంగా ఉంటుంది, ఇది దాని RNA బైండింగ్ మరియు/లేదా పరస్పర చర్య ద్వారా ప్రచారం చేయబడుతుంది. మరొక RTC ప్రోటీన్.nsp9 అందించిన UMP భాగాన్ని nsp7/8/nsp12-మధ్యవర్తిత్వ ఒలిగౌరిడైలేషన్ కోసం "ప్రైమర్"గా ఉపయోగించవచ్చు, జన్యుసంబంధమైన RNAలో 3??²-పాలీ(A) టెయిల్ లేదా మరొక ఒలిగో (A)-కలిగిన సీక్వెన్స్‌ని ఉపయోగిస్తుంది. picornavirus VPg ప్రోటీన్ (44) కోసం ఏర్పాటు చేసిన మెకానిజం మాదిరిగానే టెంప్లేట్‌గా పనిచేస్తుంది.ప్రతిపాదన "నాన్-నార్మేటివ్" అయితే ఏమి చేయాలి????(ప్రోటీన్-ప్రేరిత) నెగటివ్-స్ట్రాండ్ ఆర్‌ఎన్‌ఏ సంశ్లేషణ ప్రారంభించడం పరిశీలనలకు లింక్‌ను అందిస్తుంది, ఇది కరోనావైరస్ నెగటివ్-స్ట్రాండ్ ఆర్‌ఎన్‌ఏ చివరిలో UMP (UTPకి బదులుగా) ఉందని సూచిస్తుంది (42), ఇది సూచించడానికి పరిగణించబడుతుంది న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ డైసర్ అనేది తెలియని యూరిడిన్-నిర్దిష్ట ఎండోన్యూకలీస్ ద్వారా ఫాస్ఫోరైలేట్ చేయబడిన ముగింపును విడదీస్తుంది.ధృవీకరించబడితే, ఈ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ హైడ్రోలైటిక్ చర్య nsp9 యొక్క ఒలిగోమెరిక్ UMPylated రూపాన్ని నాసెంట్ నెగటివ్ స్ట్రాండ్ యొక్క 5² ముగింపు నుండి విడుదల చేయడంలో సహాయపడుతుంది.ప్రోటీన్ ప్రైమింగ్‌లో nsp9 యొక్క సాధ్యమైన పాత్ర మునుపటి రివర్స్ జెనెటిక్స్ అధ్యయనాలకు అనుగుణంగా ఉంటుంది, ఇవి nsp9 (మరియు nsp8) క్రిటికల్‌గా మరియు ప్రత్యేకంగా సిస్-యాక్టింగ్ ఆర్‌ఎన్‌ఏ ఎలిమెంట్‌తో కరోనా వైరస్ జన్యువు యొక్క 3 చివరన సంకర్షణ చెందుతుందని చూపించాయి.45)ఈ నివేదిక ప్రకారం, ఈ మునుపటి పరిశీలనలను ఇప్పుడు మళ్లీ పరిశీలించవచ్చు మరియు తదుపరి పరిశోధన ద్వారా విస్తరించవచ్చు.
సారాంశంలో, మా డేటా N- టెర్మినస్ వద్ద RdRpకి లింక్ చేయబడిన యాజమాన్య సమూహ వైరస్ ఎంజైమ్ ట్యాగ్ యొక్క నిర్దిష్ట కార్యాచరణను నిర్ణయించింది.కరోనావైరస్లో, కొత్తగా కనుగొనబడిన ఈ NiRAN-మధ్యవర్తిత్వ UMPylator/NMPylator కార్యాచరణ Mn2+ మరియు ప్రక్కనే ఉన్న Asn అవశేషాలపై ఆధారపడటానికి ఉపయోగించబడుతుంది మరియు N-టెర్మినల్ ప్రైమరీ అమైన్‌తో (తక్కువ-శక్తి) ఫాస్ఫోరమిడేట్ బంధాలను ఏర్పరుస్తుంది.nsp8|9 క్లీవేజ్ సైట్ వద్ద Mpro-మధ్యవర్తిత్వ క్లీవేజ్ ద్వారా, nsp9 లక్ష్యం NMPylation కోసం ఉపయోగించబడుతుంది, ఇది ప్రోటీజ్ మరియు NiRAN డొమైన్ మధ్య ఫంక్షనల్ కప్లింగ్‌ను సూచిస్తుంది, ఇది RdRp వరకు విస్తరించింది.nsp12 NiRAN యాక్టివ్ సైట్‌లోని కీలక అవశేషాల పరిరక్షణ మరియు nsp9 లక్ష్యం, SARS-CoV-2తో సహా రెండు కరోనావైరస్ల నుండి పొందిన డేటాతో కలిపి, nsp9 NMPylation ఒక కరోనావైరస్ అని చెప్పడానికి బలమైన సాక్ష్యాలను అందిస్తుంది కన్జర్వేటివ్ లక్షణాలు వైరస్ ప్రతిరూపణలో కీలక దశ.ప్రోటీన్-ప్రేరిత RNA సంశ్లేషణలో NSP9 యొక్క NMPylated రూపం యొక్క నిర్దిష్ట పాత్ర కరోనావైరస్ మరియు ఇతర సమూహ వైరస్‌లకు సహేతుకమైన దృష్టాంతం అని మరియు NiRAN ఇతర గుర్తించబడని ప్రోటీన్లను కూడా లక్ష్యంగా చేసుకోవచ్చని అందుబాటులో ఉన్న డేటా మాకు నిర్ధారించింది.వైరస్‌ను నియంత్రించండి.హోస్ట్ ఇంటరాక్షన్.ధృవీకరించబడితే, వైరల్ RNA సంశ్లేషణలో ప్రోటీన్ ప్రైమర్‌ల ప్రమేయం గతంలో కనుగొనబడిన కరోనావైరస్ మరియు పికార్నావైరస్ లాంటి సూపర్‌గ్రూప్ (9) మధ్య Mpro/3CLpro మరియు RdRp డొమైన్‌ల సీక్వెన్స్ అనుబంధాన్ని పెంచుతుంది (9), ఇవి ఇప్పుడు ఇటీవల స్థాపించబడిన పిసోనివైరైట్స్‌లో ఏకీకృతం చేయబడ్డాయి ( 46) వర్గంలో.
ఈ అధ్యయనంలో గుర్తించబడిన ప్రాథమిక, ఎంపిక మరియు సాంప్రదాయిక ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలు యాంటీవైరల్ ఔషధాలకు లక్ష్యంగా ఉపయోగించవచ్చని మా డేటా చూపిస్తుంది.NiRAN యొక్క క్రియాశీల సైట్‌లో సంరక్షించబడిన nsp9 N- టెర్మినస్ యొక్క బైండింగ్ (మరియు తదుపరి మార్పు)కి అంతరాయం కలిగించే సమ్మేళనాలు ప్రభావవంతమైన మరియు బహుముఖ యాంటీవైరల్ మందులుగా అభివృద్ధి చేయబడతాయి, వివిధ (ఉప) జాతి ఇన్ఫెక్షన్ల నుండి జంతు మరియు మానవ కరోనావైరస్ల చికిత్సకు తగినవి. SARS-CoV-2 మరియు మిడిల్ ఈస్ట్ రెస్పిరేటరీ సిండ్రోమ్ కరోనా వైరస్‌తో సహా.
ఈ అధ్యయనంలో ఉత్పత్తి చేయబడిన కరోనావైరస్ ప్రోటీన్ యొక్క కోడింగ్ క్రమాన్ని RT-PCR ద్వారా HCoV-229E లేదా SARS-CoV-2 సోకిన Vero E6 సోకిన Huh-7 నుండి వేరుచేయబడిన RNA ఉపయోగించి విస్తరించబడింది మరియు ప్రామాణిక క్లోనింగ్ విధానాలను ఉపయోగించి చొప్పించబడింది.pMAL-c2 (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాజికల్ లాబొరేటరీ) లేదా pASK3-Ub-CHis6 (47) వ్యక్తీకరణ వెక్టర్ (SI అనుబంధం, పట్టికలు S1 మరియు S2).PCR-ఆధారిత సైట్-డైరెక్ట్ మ్యూటాజెనిసిస్ (48) ద్వారా సింగిల్ కోడాన్ ప్రత్యామ్నాయాలు ప్రవేశపెట్టబడ్డాయి.MBP ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి, E. కోలి TB1 కణాలు తగిన pMAL-c2 ప్లాస్మిడ్ నిర్మాణంతో రూపాంతరం చెందాయి (SI అనుబంధం, టేబుల్ S1).ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్ అమిలోస్ అఫినిటీ క్రోమాటోగ్రఫీ ద్వారా శుద్ధి చేయబడింది మరియు కారకం Xaతో క్లీవ్ చేయబడింది.తదనంతరం, C-టెర్మినల్ His6-ట్యాగ్ చేయబడిన ప్రోటీన్ గతంలో వివరించిన విధంగా Ni-ఇమ్మొబిలైజ్డ్ మెటల్ అఫినిటీ క్రోమాటోగ్రఫీ (Ni-IMAC) ద్వారా శుద్ధి చేయబడింది (49).ubiquitin ఫ్యూజన్ ప్రోటీన్‌ను ఉత్పత్తి చేయడానికి, E. coli TB1 కణాలు తగిన pASK3-Ub-CHis6 ప్లాస్మిడ్ నిర్మాణం (SI అనుబంధం, పట్టికలు S1 మరియు S2) మరియు pCGI ప్లాస్మిడ్ DNA ఎన్‌కోడింగ్ ubiquitin-నిర్దిష్ట C-టెర్మినల్ హైడ్రోలేస్ 1 (Ubp1)ను ఉపయోగించాయి.పరివర్తన (47).C-టెర్మినల్ His6-ట్యాగ్ చేయబడిన కరోనావైరస్ ప్రోటీన్ గతంలో వివరించిన విధంగా శుద్ధి చేయబడింది (50).
HCoV-229E nsp12-His6 యొక్క స్వీయ-NMPylation పరీక్ష EAV nsp9 (16)లో వివరించిన విధంగా నిర్వహించబడింది.సంక్షిప్తంగా, nsp12-His6 (0.5 µM)లో 50 mM 4-(2-హైడ్రాక్సీథైల్)-1-పైపెరాజినీథనేసల్ఫోనిక్ యాసిడ్ (HEPES)-KOH, pH 8.0, 5 mM డిథియోత్రీటాల్ (DTT), 6 mM MnCl2, buffer 25 పేర్కొన్న NTP మరియు 0.17 µM 30 నిమిషాలకు 30 °C వద్ద [α32-P]NTP (3,000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) సరిపోలాయి.nsp12-మధ్యవర్తిత్వ nsp9 NMPylation యొక్క అన్ని ఇతర (ప్రామాణిక) NMPylation పరీక్షలలో, ప్రతిచర్య పరిస్థితులు క్రింది విధంగా సర్దుబాటు చేయబడతాయి: nsp12-His6 (0.05 µM) మరియు nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH సమక్షంలో. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM సూచించిన NTP, మరియు 0.17 µM సరిపోలిన [α32-P]NTP.30°C వద్ద 10 నిమిషాలు పొదిగిన తర్వాత, ప్రతిచర్య నమూనా SDS-PAGE నమూనా బఫర్‌తో కలపబడింది: 62.5 mM tris (హైడ్రాక్సీమీథైల్) అమినోమెథేన్ HCl (pH 6.8), 100 mM DTT, 2.5% SDS, 10% గ్లిసరాల్ మరియు 0.0005% నీలం.5 నిమిషాల పాటు 90 °C వద్ద వేడి చేయడం ద్వారా ప్రోటీన్ డీనాట్ చేయబడింది మరియు 12% SDS-PAGE ద్వారా వేరు చేయబడింది.జెల్ కుమాస్సీ బ్రిలియంట్ బ్లూ సొల్యూషన్ (40% మిథనాల్, 10% ఎసిటిక్ యాసిడ్, 0.05% కూమాస్సీ బ్రిలియంట్ బ్లూ R-250)తో స్థిరంగా ఉంటుంది మరియు స్టెయిన్ చేయబడింది, డీకోలరైజ్ చేయబడి, 20 గంటల పాటు ఫాస్ఫోరేసెంట్ ఇమేజింగ్ స్క్రీన్‌కు (NMP12 నుండి nsp12ని గుర్తించడానికి) బహిర్గతం చేయబడుతుంది. లేదా (గరిష్టంగా) 2 గంటలు (nsp9 NMPylation అంచనా వేయడానికి).స్క్రీన్‌ను స్కాన్ చేయడానికి టైఫూన్ 9200 ఇమేజర్ (GE హెల్త్‌కేర్) ఉపయోగించబడింది మరియు సిగ్నల్ తీవ్రతను విశ్లేషించడానికి ImageJ ఉపయోగించబడింది.
MS విశ్లేషణ కోసం, NMPylation విశ్లేషణ (SI అనుబంధం, టేబుల్ S1)లో 1 µM nsp12-His6 మరియు 10 µM nsp9 (హెక్సాహిస్టిడిన్ ట్యాగ్ లేకుండా) ఉపయోగించబడ్డాయి మరియు 500 µM UTP మరియు GTP యొక్క పెరిగిన ఏకాగ్రత ఉపయోగించబడింది.వాటి ఏకాగ్రత మరియు ఆశించిన ప్రోటీన్ నాణ్యతపై ఆధారపడి, మాస్‌ప్రెప్ కాలమ్ (వాటర్స్)తో కూడిన వాటర్స్ అక్విటీ హెచ్-క్లాస్ హెచ్‌పిఎల్‌సి సిస్టమ్ 1 నుండి 10 µL బఫర్డ్ ప్రోటీన్ సొల్యూషన్‌లను ఆన్‌లైన్‌లో డీసాల్ట్ చేయడానికి ఉపయోగించబడింది.బఫర్ A (నీరు/0.05% ఫార్మిక్ యాసిడ్) మరియు బఫర్ B (అసిటోనిట్రైల్/0.045% ఫార్మిక్ యాసిడ్) యొక్క క్రింది గ్రేడియంట్ ద్వారా డీసాల్టెడ్ ప్రోటీన్ సినాప్ట్ G2Si మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (వాటర్స్) యొక్క ఎలెక్ట్రోస్ప్రే అయాన్ సోర్స్‌లోకి పంపబడుతుంది మరియు కాలమ్ ఉష్ణోగ్రత 60 ° C మరియు ఫ్లో రేట్ 0.1 mL/min: 2 నిమిషాలకు 5% Aతో ఐసోక్రటిక్‌గా ఎల్యూషన్, తర్వాత 8 నిమిషాల్లో 95% Bకి లీనియర్ గ్రేడియంట్ మరియు మరో 4 నిమిషాల పాటు 95% Bని నిర్వహించండి.
500 నుండి 5000 m/z ద్రవ్యరాశి పరిధి కలిగిన సానుకూల అయాన్లు కనుగొనబడ్డాయి.ఆటోమేటిక్ మాస్ డ్రిఫ్ట్ కరెక్షన్ కోసం గ్లూ-ఫైబ్రినోపెప్టైడ్ B ప్రతి 45 సెకన్లకు కొలుస్తారు.బేస్‌లైన్‌ను తీసివేసి, సున్నితంగా మార్చిన తర్వాత సగటు స్పెక్ట్రమ్‌ను డీకాన్వాల్వ్ చేయడానికి MaxEnt1 పొడిగింపుతో MassLynx ఇన్‌స్ట్రుమెంట్ సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించండి.
UMPylated HCoV-229E nsp9 సీక్వెన్సింగ్-గ్రేడ్ మోడిఫైడ్ ట్రిప్సిన్ (సర్వా)ని జోడించడం ద్వారా జీర్ణం చేయబడింది మరియు రాత్రిపూట 37 °C వద్ద పొదిగేది.పెప్టైడ్‌లను డీసాల్ట్ చేయడానికి మరియు కేంద్రీకరించడానికి క్రోమాబాండ్ C18WP స్పిన్ కాలమ్ (పార్ట్ నంబర్ 730522; మాచెరీ-నాగెల్) ఉపయోగించబడింది.చివరగా, పెప్టైడ్ 25 µL నీటిలో కరిగిపోతుంది, ఇందులో 5% అసిటోనిట్రైల్ మరియు 0.1% ఫార్మిక్ ఆమ్లం ఉంటాయి.
నమూనాలను ఆర్బిట్రాప్ వెలోస్ ప్రో మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ (థర్మో సైంటిఫిక్) ఉపయోగించి MS విశ్లేషించింది.అంతిమ నానో HPLC సిస్టమ్ (డయోనెక్స్), కస్టమ్ ఎండ్-మౌంటెడ్ 50 సెం.మీ ??75 μm C18 RP కాలమ్ 2.4 μm మాగ్నెటిక్ పూసలతో ప్యాక్ చేయబడింది (డా. ఆల్బిన్ మైష్ హై పెర్ఫార్మెన్స్ LC GmbH) ప్రోక్సీయాన్ నానోస్ప్రే సోర్స్ ద్వారా ఆన్‌లైన్‌లో మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్‌కు కనెక్ట్ చేయండి;300 µm లోపలి వ్యాసంలో 6 µL ట్రిప్సిన్ జీర్ణక్రియ ద్రావణాన్ని ఇంజెక్ట్ చేయండి ×??1 cm C18 PepMap ప్రీ-కాన్సెంట్రేషన్ కాలమ్ (థర్మో సైంటిఫిక్).నీరు/0.05% ఫార్మిక్ యాసిడ్‌ను ద్రావకం వలె ఉపయోగించి, నమూనా స్వయంచాలకంగా ట్రాప్ చేయబడింది మరియు 6 µL/min ప్రవాహం రేటుతో డీశాలినేట్ చేయబడింది.
300 nL/min ప్రవాహం రేటుతో ట్రిప్టిక్ పెప్టైడ్‌ల విభజనను సాధించడానికి క్రింది నీరు/0.05% ఫార్మిక్ ఆమ్లం (ద్రావకం A) మరియు 80% అసిటోనిట్రైల్/0.045% ఫార్మిక్ ఆమ్లం (ద్రావకం B) ఉపయోగించబడ్డాయి: 4% B 5 నిమిషాలు, ఆపై నిమిషాల్లో 30 A లీనియర్ గ్రేడియంట్ 45% B, మరియు 5 నిమిషాల్లో 95% ద్రావకం Bకి లీనియర్ పెరుగుదల.క్రోమాటోగ్రాఫిక్ కాలమ్‌ను స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ నానో-ఎమిటర్ (ప్రోక్సియాన్)కు కనెక్ట్ చేయండి మరియు 2,300 V సంభావ్యతను ఉపయోగించి మాస్ స్పెక్ట్రోమీటర్ యొక్క వేడిచేసిన కేశనాళికకు నేరుగా ఎలుయెంట్‌ను స్ప్రే చేయండి. ఆర్బిట్రాప్ మాస్ ఎనలైజర్‌లో 60,000 రిజల్యూషన్‌తో సర్వే స్కాన్ అనుబంధించబడింది. కనీసం మూడు డేటా MS/MS స్కాన్‌లతో, డైనమిక్‌గా 30 సెకన్ల పాటు మినహాయించబడి, లీనియర్ అయాన్ ట్రాప్ కొలిషన్ ప్రేరిత డిస్సోసియేషన్ లేదా ఆర్బిట్రాప్ డిటెక్షన్‌తో కలిపి అధిక శక్తి తాకిడి డిస్సోసియేషన్ ఉపయోగించి, రిజల్యూషన్ 7,500.
పోస్ట్ సమయం: ఆగస్ట్-03-2021